適応塩化カルシウム手順を用いて大腸菌細胞の形質転換

ソース: ナタリア・マーティン¹, アンドリュー・J・ヴァン・アルスト¹, リアノン・M・ルヴェーク¹, ビクター・J・ディリタ^1
1ミシガン州立大学微生物学・分子遺伝学専攻

細菌は、水平遺伝子導入として知られているプロセスで遺伝物質(デオキシリボヌクレイン酸、DNA)を交換する能力を有する。外因性DNAを組み込むことは、細菌が自然の生息地に見られる抗生物質や抗体(1)または分子の存在など、変化する環境条件に適応することを可能にする新しい遺伝的形質を獲得できるメカニズムを提供する。(2)水平遺伝子導入には、形質転換、経転移、共役の3つのメカニズムがある(3)ここでは、環境から自由なDNAを取り込む細菌の能力、形質転換に焦点を当てます。実験室では、形質転換プロセスには、4つの一般的なステップがあります:1)有能な細胞の調製、2)DNAを用いて有能な細胞のインキュベーション、3)細胞の回収、および4)形質転換剤の増殖のための細胞のめっき(図1)。

図 1: 変換プロセスの一般的な手順。形質転換プロセスには、4つの一般的なステップがあります:1)有能な細胞の調製、2)DNAによるインキュベーション、3)細胞の回収、4)形質転換剤の増殖のためのめっき細胞。

変換が起こるには、レシピエント細菌が能力と呼ばれる状態である必要があります。一部の細菌は、特定の環境条件に応じて自然に有能になる能力を持っています。しかし、他の多くの細菌は自然に有能にならないか、またはこのプロセスの条件はまだ不明です。DNAを細菌に導入する能力は、目的とするDNA分子の複数のコピーを生成し、大量のタンパク質を発現させる、クローニング手順の構成要素として、他の研究用途の範囲を持っています。分子生物学への変換の価値のために、自然な能力のための条件が不明な場合に細胞を人工的に有能にすることを目的としたいくつかのプロトコルがあります。人工的に有能な細胞を調造するには、1)細胞の化学処理を通じて、2)細胞を電気パルス(エレクトロポレーション)にさらす2つの主な方法が使用されます。前者は、DNAと細胞表面の間に引力を生み出す手順に応じて異なる化学物質を使用し、後者は電界を使用してDNA分子が入り込むことができる細菌細胞膜の細孔を生成します。化学的能力のための最も効率的なアプローチは、二価陽イオンを用いてインキュベーションであり、最も顕著なカルシウム(Ca2+)(4,5)カルシウム誘発能力は、ここで説明する手順である(6)。この方法は、主にグラム陰性細菌の形質転換に使用され、それはこのプロトコルの焦点になります。

化学的変換の手順は、細胞が化学的能力を誘発するために陽イオンにさらされる一連のステップを伴う。これらのステップは、その後、温度変化-ヒートショック-有能な細胞による外来DNAの取り込みを支持する(7)。細菌細胞の封筒は負の帯電である。大腸菌のようなグラム陰性菌では、外膜はリポ多糖(LPS)の存在により負の帯電(8)である。これにより、同様に負電荷を帯んだDNA分子の反発が生じる。化学的能力誘導において、正に帯電したカルシウムイオンは、この電荷反発を中和し、細胞表面へのDNA吸光を可能にする(9)。DNAによるカルシウム処理とインキュベーションは氷上で行われます。続いて、より高い温度(42°C)でのインキュベーション、ヒートショックが行われる。この温度の不均衡は、DNAの取り込みをさらに有利にします。細菌細胞は、ヒートショック治療に耐えるために、中指数成長期である必要があります。他の成長段階では、細菌細胞は熱に敏感になりすぎて、変換効率が大幅に低下する生存率の損失をもたらす。

異なるDNA源を変換に使用できます。典型的には、プラスミドは、小さな円形、二本鎖DNA分子、大腸菌におけるほとんどの実験室手順における形質転換に使用される。プラスミドを形質転換後に細菌細胞に維持するには、複製の起源を含む必要があります。これにより、細菌染色体とは独立して細菌細胞内で複製することができる。すべての細菌細胞が形質転換手順中に変換されるわけではありません。したがって、形質転換は、形質転換された細胞と非形質化された細胞の混合物をもたらす。これら2つの集団を区別するために、プラスミドを獲得した細胞を同定する選択方法が用いられる。プラスミドは通常、選択可能なマーカーを含み、これは成長の利点を与える形質をコードする遺伝子である(すなわち、抗生物質または化学的または成長性の補助性からの救助に対する耐性)。形質転換後、細菌細胞は選択的培地上にめっきされ、形質転換細胞の増殖のみが可能となる。所定の抗生物質に対する耐性を与えるプラスミドで形質転換した細胞の場合、選択的培養剤はその抗生物質を含む増殖培養剤となる。選択的培養剤中に成長したコロニーが形質転換体であることを確認するためにいくつかの異なる方法を使用することができます(すなわち、プラスミドを組み込んだ)。例えば、プラスミドはプラスミド調製法(10)を用いてこれらの細胞から回収し、プラスミドサイズを確認するために消化することができる。あるいは、コロニーPCRは、目的のプラスミド(11)の存在を確認するために使用することができる。

この実験の目的は、塩化カルシウム手順(12)の適応を用いて大腸菌DH5α化学的に有能な細胞を調作し、プラスミドpUC19でそれらを変換して変換効率を決定することである。大腸菌株DH5αは、分子生物学アプリケーションで一般的に使用される株です。その遺伝子型、特にrecA1およびendA1のために、この株は挿入安定性を高め、その後の調製におけるプラスミドDNAの質を改善することを可能にする。DNAのサイズが大きくなると形質転換効率が低下するため、プラスミドpUC19はサイズが小さい(2686 bp)のでこのプロトコルで使用された(https://www.mobitec.com/cms/products/bio/04_vector_sys/standard_cloning_vectors.html参照ベクトルマップ)。pUC19はアンピシリンに対する耐性を付与し、したがって、これは選択に使用される抗生物質であった。

このプロトコルは、塩化カルシウム手順(12)の適応を用いて有能な大腸菌DH5αの調製および形質転換について説明する。

1. セットアップ

1. 機器
   • 分光 光度 計
   • ソルバル遠心分離機(または同等)
   • ベンチトップ遠心分離機
   • ヒートブロックまたは水浴
   • オービタルシェーカー
   • ステーナリーインキュベーター
   • ゲル鋳造トレイ
   • まあ櫛
   • 電圧源
   • ゲルボックス
   • 紫外線光源
   • マイクロ波
2. ソリューションと試薬
   • ルリア・ベルタニ(LB)スープ(10gカゼイン酵素加水分解物、5g酵母エキス、5g塩化ナトリウム100

TEは多くの要因に依存しているが、このような非商業的な有能な細胞製剤は、通常、プラスミドのマイクログラム当たり10^{6〜10 7}形質転換体を得る。したがって、この調製物は、TE= 2.46 x 10⁸ cfu/μgを有し、TEが予想範囲をはるかに超えた。特定のアプリケーションに対して高い変換効率が必要な場合に、超有能なセルを作成するための追加のプロ?...

形質転換は、研究室の多くの分子生物学アプリケーションの鍵となる細菌細胞に外因性DNAを導入するための強力な方法です。さらに、細菌細胞が遺伝性の変化を増加させ、幅広い条件下で生存のための異なる有益な形質の獲得を可能にする遺伝物質を交換できるようにすることで、自然界で大きな役割を果たしています。多くの細菌株は、自然な能力に必要な遺伝子をコードします。しかし?...

1. Croucher, N. J. et al. Rapid pneumococcal evolution in response to clinical interventions. Science. 331 (6016):430-434. (2011)
2. Borgeaud, S. et al. The type VI secretion system of Vibrio cholerae fosters horizontal gene transfer. Science. 347(6217):63-67. (2015)
3. Burmeister, A. R. Horizontal Gene Transfer. Evol Med Public Health. 2015 (1):193-194. (2015)
4. Weston A, Brown MG, Perkins HR, Saunders JR, Humphreys GO. Transformation of Escherichia coli with plasmid deoxyribonucleic acid: calcium-induced binding of deoxyribonucleic acid to whole cells and to isolated membrane fractions. J Bacteriol. 145 (2):780-7. (1981)
5. Dagert M, Ehrlich SD. Prolonged incubation in calcium chloride improves the competence of Escherichia coli cells. Gene. 6 (1):23-8. (1979)
6. Asif A, Mohsin H, Tanvir R, and Rehman Y. Revisiting the Mechanisms Involved in Calcium Chloride Induced Bacterial Transformation. Front Microbiol. 8:2169. (2017)
7. Panja S, Aich P, Jana B, Basu T. How does plasmid DNA penetrate cell membranes in artificial transformation process of Escherichia coli? Mol Membr Biol. 25 (5):411-22. (2008)
8. Silhavy, TJ, Kahne D, Walker S. The Bacterial Cell Envelope. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2 (5): a000414. (2010)
9. Panja S, Aich P, Jana B, Basu T. (2008) Plasmid DNA binds to the core oligosaccharide domain of LPS molecules of E. coli cell surface in the CaCl2-mediated transformation process. Biomacromolecules. 9 (9):2501-9.
10. JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Plasmid Purification. JoVE, Cambridge, MA. (2018)
11. Bergkessel M and Guthrie C. Colony PCR. Methods in Enzymology. 529: 299-309. (2013)
12. Sambrook J and Russell DW. Molecular Cloning A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY.Protocol 25 (1.116-118). (2001)
13. Wirth R, Friesenegger A, Fiedler S. Transformation of various species of gram-negative bacteria belonging to 11 different genera by electroporation. Molecular & General Genetics. 216 (1): 175-7. (1989)