この材料は、研究サポートされている（またはによって部分的にサポートされている）技術の商業オフィス、ソルトレイクシティ、ユタ州、研究開発のオフィス、リハビリテーションR＆Dサービス、DVA SLCヘルスケアシステム、ソルトレイクシティ、ユタ州、国防総省に基づいているPRMRPグラント（第PR054520）、アルバート＆マーガレットホフマンの議長と整形外科の科は、医学のユタ大学大学、ソルトレイクシティ、ユタ州、シミュレーションのための技術サポートは、科学コンピューティングの統合生物医学コンピューティングのためにセンターから提供されたとイメージング研究所と統合生物医学コンピューティングのためのNIH / NCRRセンター、P41 - RR12553 - 07からのソフトウェアによって部分的に可能となった 。 追加の感謝は、バイオフィルムの画像のための原稿の準備とダスティンウィリアムズの支援についてはGwenevereショーに拡張されます。

パート1：手足を失った人復興のためにコンピューター断層撮影​​（CT）スキャンを用いて<ol><li>レトロスペクティブCTスキャンは、IRBとHIPAAの承認を得た後、ユタ州とベテランの担当病院の部の大学から収集した。 </li><li>彼らはX線の吸収性に基づいて、組織の種類を明確に区別できるため、CTスキャンを選択した。 </li><li> CTSは、手動で検査し、画像のアーチファクトを防ぐために金属インプラントの欠如に基づいて、研究に含まれていた。 </li></ol>パート2：Seg3Dでモデル生成<ol><li>ファイルは、DICOM画像としてダウンロードし、新しいボリュームとしてSeg3D（バージョン1.11.0、software.sci.utah.edu）に装填した。 </li><li>メディアンフィルタは、幾何学的に定義された組織構造を決定する前に、インポートされたボリュームを滑らかにするために使用されていました。 </li><li>骨、骨髄、臓器や脂肪組織の組織の境界は、対話的にCTファイルを（図1）閾値処理によって生成されました。 <img src="/files/ftp_upload/1237/1237fig1.jpg" alt="図1" /> 図1：特定の組織型に閾値処理と分離された切断者断端の矢状断面。 </li><li>筋肉は、手動で閾値筋肉組織の内部のシード点を設定し、シード点に接続されているすべての組織を検索するフィルタを接続して自信を用いて得られた。このステップでは、CTSから同じような吸収性に基づいて、筋肉と一緒にグループ化されている可能性が誤った組織を排除。 </li><li> CT画像から確実に識別することは不可能だった皮膚が、、フルモデル1を囲まれた均質な厚さの層を生成するために平均的な皮膚の厚さに基づいて、一番外側の組織2ミリメートルを拡張することによって生成されました。 </li><li>セグメンテーションを手動で検査され、精度を確保するために修正し、有限要素解析（図1）に必要な単一のラベルのマップに階層で組み合わせる。 <img src="/files/ftp_upload/1237/1237fig2.jpg" alt="図2" /> 図2：Seg3Dで作成された二国間切断者の代表階層モデル。 </li></ol>パート3：有限要素解析のための準備<ol><li> 10cmのインプラントが移植された整形外科装置と電気刺激のための陰極として機能するために、MATLABで設計され、SCIRun（バージョン4.0、software.sci.utah.edu）にインポートされました。 </li></ol>パート4：電極の配置とデザイン<ol><li>それは対話型の電極配置とシミュレーションをサポートしているのでSCIRunは、電極の設計のために利用されました。 </li><li>ネットワークが作成され、モジュールは、メッシュ（図3）を生成するために特定の関数で開催された。モジュールは、境界条件、組織の導電率、メッシュの改良、Matlabのヒストグラムを生成し、記録するフィールドのデータ、など（表1）を定義するための重要であった。 <img src="/files/ftp_upload/1237/1237fig3.jpg" alt="図3" /> 図3：2つのバンドの外部電極構成を使用するパイロット研究からの代表的なネットワークのイメージ。 <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tbody><tr><td> 表1 </td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> セグメント化された組織に割り当てられた導電率 </td></tr><tr><td> 組織のタイプ </td><td> 導電率[S / M] </td></tr><tr><td>臓器</td><td> 0.22 </td></tr><tr><td>スキン</td><td> 0.26 </td></tr><tr><td>脂肪</td><td> 0.09 </td></tr><tr><td>筋肉</td><td> 0.25 </td></tr><tr><td>皮質骨</td><td> 0.02 </td></tr><tr><td>骨髄</td><td> 0.07 </td></tr></tbody></table></li><li>電極の構成は、1つのパッチ電極、2つのパッチ電極を、一つの連続バンド二連続のバンドから成っていた。 </li><li>外部電極のバンドは、患者のCTスキャンから生成されたモデルの残肢に適用され、厚さ1.6センチメートルであった。 </li><li>電極のパッチは、断端の約半分の直径をカバーするストリップとして配置し、厚さ3センチであった。 </li><li>オッセオインテグレーテッドインプラントを表す内側の皮質インプラントは完璧なインプラントのフィット感を可能にすると2を埋めるために骨内膜の直径に設定されていました。 </li></ol>パート5：有限要素解析<ol><li>シミュレーションは、電気のメトリックが時間がないの依存性と準静的アプローチを用いて計算することができたと仮定して生成されていました。 </li><li>モデルはSeg3Dセグメンテーションから生成された各組織のタイプのラプラスの方程式を解くことで計算された。 </li><li>境界条件は、電流と電流が体中に残っているガイドラインを注入すること、電極を形成した。 </li><li>電極とインプラントが周囲の組織よりもはるかに大きな導電性を持っていたので、それがあったインプラント（カソード）が一定の電位であることssumed、同様に表面電極を経皮インプラントから一定の電位差でモデル化しました。 </li><li>電極構成とサイジングの有効性を評価するために、患者の特定のモデルが開発され、インプラントの界面付近の電位は、ローカライズされた電界強度を決定するために使用されていました。 </li><li>モデルは区分的に、均質な抵抗と等方性として扱われていた約180万要素で構成された六面体メッシュを使用して生成されました。 </li><li>この実験のための最適なモデルは、相対的な差&lt;5％モデルの精度（表2）を保証するためにメッシュの感度調査で確認された電圧勾配にして選ばれました。 <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0" width="305"><tbody><tr><td> 表2 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="3"> 手足を失った人モデルのメッシュの感度に関する研究 </td><td></td></tr><tr><td> メッシュ </td><td> 要素は </td><td> ノード </td><td> 相対的差異 </td></tr><tr><td> 100 100 50 </td><td> 149089 </td><td> 161131 </td><td> 0.0995 </td></tr><tr><td> 125 125 75 </td><td> 350180 </td><td> 371472 </td><td> 0.0802 </td></tr><tr><td> 150 150 100 </td><td> 673032 </td><td> 706082 </td><td> 0.0545 </td></tr><tr><td> 175 175 125 </td><td> 1146778 </td><td> 1194044 </td><td> 0.0527 </td></tr><tr><td> 200 200 150 </td><td> 1796690 </td><td> 1860772 </td><td> 0.0439 </td></tr><tr><td> 250 250 200 </td><td> 3745038 </td><td> 3850202 </td><td> 0.0364 </td></tr><tr><td> 275 275 225 </td><td> 5097243 </td><td> 5226587 </td><td> 0.0301 </td></tr><tr><td> 300 300 250 </td><td> 6742588 </td><td> 6898729 </td><td> 0.0000 </td></tr></tbody></table></li><li>反復解法を用いて、有限要素モデルの電気メトリックは、電極構成のために計算された。 </li></ol>

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技術は、特に、骨格添付ファイルを高めるリハビリを減らし、細菌の付着は、ジャーナルの投稿の最初の著者によって発明された斬新なアイデアである防ぐために機能的な陰極として整形外科インプラントを利用して、記事に開示。発明の開示のフォームは、ユタ大学に提出されており、米国仮特許が開示さ、すべての技術を守る提出されています。

電気刺激のパラダイムを理解する戦闘のフィールド上に医療や避難戦略の強化は、悲惨な戦争災害の存続の戦士の数の増加につながるている。生存率の改善率は医学の進歩ですが、軍人と女性はベテラン総務のヘルスケアシステム3からの集中的なフォローアップケア、豊富なリハビリと高価な補綴サービスを必要とする切断して戦闘から戻ってきている。 1,000人以上の戦争関連の切断は、不朽の自由作戦（OEF）とイラクの自由作戦（OIF）の衝突4の結果として発生したことを議会のレポートの詳細。 OEFとOIFのベテランの場合には、戻って戦士の約15％が複数の手足を失っているし、戻って軍人と女性のかなりの数がソケットの技術がオプションでない場合、または患者によって拒否された短い残肢を持っている。上肢の使用は補綴中止固定装置が快適に5使用する煩雑で困難であるため、さらに50％を超えると報告した。下肢人工関節も同様に問題があると軟部組織のソケットに関連付けられている一般的な問題は、挑戦的なterrain6の上を歩くことができない、限られた断端の長さ7、患者の不快感5、非生理的な負荷8との懸念、異所性骨化9とのリスクから刺激を含める衰弱性疾患10。しかし、オッセオインテグレーション技術は、痛み11、皮膚刺激12を減少させるモビリティ6を向上させる、osseoperception 13を高めるため、ソケット6に関連付けられ褥瘡を減少させる、歩行7,14のためのエネルギーを削減し、より限定的にベテランと戦士に仕えることができる新たな手術手技です。断端の長さ15。 オッセオインテグレーションの多数の物理的および心理的な利点にもかかわらず、関連する外科的処置は、より高度な感染予防治療streategies 16を必要とする長いリハビリのプログラムを必要とし、1.5年術後17にまで続くことがある制限された体重負荷のプロトコルが含まれています。断端のホスト骨と長さの生存率はオッセオインテグレーションが軍人と女性を返すための鍵となる改善するための新しいデバイスを開発し、筋肉の付着と機能性のために重要ですので。したがって、制御された電気刺激を使用してosseointegratedインテリジェントインプラントの設計（OIID）システムの開発は、リハビリの長さを短くし、ベテランと戦士の手足を失った人のための骨格添付ファイルを増やすことができます。現在のデバイスは、市販の経皮osseointegratedインプラントで使用するように指示されていないので、しかし、、プログラムの動機は、有限要素解析で安全性と有効性を確認することです。 osteoidsと鉱化作用の堆積特に、骨リモデリングにおける電気刺激の役割を理解し、投機的な推移している。しかし、骨で観察された電気的活動は、機械的荷重18,19の結果であるかもしれません、したがって、電気刺激は、骨の修復19を誘導するための効果的なメカニズムかもしれない。仮説の背後にあるロジックは、骨折治癒モデルで説明されています。長骨がロードされると、緊張の側は、陽性のになり、骨が壊れて一度治癒が開始されたと恒常性が21を再開するまで、圧縮側の電気陰性20,21は 、しかし、、サイトは周囲の環境を基準にして電気的に陰性のままになります。電気信号で自然治癒カスケードのシミュレーションにはカルシウム沈着22、酸素含有量とpHが23のわずかな変化、成長因子22の採用を支援すると考えられ、追加の細胞外マトリックス24の骨芽細胞の遊走および分泌を支援されています。 単独で電気刺激が完全な骨の修復を支配することができることを前提に再定義し、現在新たな仮説は、完全な労働組合が機械的負荷および電気刺激の共刺激19によって形成されることを提案されています。 in vivoで観察された電気インパルスは、コラーゲンの圧電変形や骨マトリックス25の過去の鉱物の部分を流れるイオン成分によって生成される大規模な電子運動電流に関連付けられています。実際には、自発的な電位が骨26のミネラル同格率の増加に6ミリボルトと相関するような大きさの骨で報告されている。 ブライトンとFriedenberg 18,21,27,28による初期の作品は、1960年代と1970年代とDで骨再生のための電気刺激の概念を用いその直流電流が従来の治療法に比べ短時間で非組合を修復するために使用される可能性emonstrated。追加モデルは、限定的な体重負荷と骨形成を調査し、コントロールと電気的に刺激された四肢25との間の骨形成活性の三十一%の増加を示している。 電気刺激の分野の研究者は、電気刺激による骨芽細胞のマトリックス沈着のメカニズムを理解するための道を切り開くことにつながりましたしながら、不十分な理解は、この技術の拡大を制限している。非組合と骨折治癒モデル、患者の不快感の例と失敗した試行の成功した治癒のケースが多い一方で、文献で ​​同様に29満ちています。電気刺激の問題は、間違った電気メトリックを制御し、もっぱら現在の大きさに集中する科学者や臨床医から発生します。以前の研究者は、おおよその50万毎年30を発生する非組合を固定する&quot;魔法の弾丸&quot;として現在に見てきました。しかし、モデル間の再現性は、ジュール加熱の合併症月31日から制限と電流密度が32決定ではないされています。ローカライズされた組織壊死および患者の不快感33を防ぐために国際電気委員会によって概説されて実際には、すべての製 ​​造バイオメディカルデバイスは2ミリアンペア/ cm 2より小さい電流密度に制限する必要があります。 余談骨格固定を補助するから、制御された電気刺激はまた、整形外科用インプラントの細菌付着を防止し、骨髄炎とバイオフィルム形成34から37のためのリスクを軽減することがあります。整形外科デバイスのバイオフィルム形成は、患者の合併症と38これらのデバイスに依存する人のための重要な苦痛につながる。重点は完全に手術前39にインストルメンテーションとインプラントを滅菌しているために必要性に置かれている、しかしそれは確かに40に感染している多くの負の培養例から明らかなように細菌の付着を診断することは困難です。この問題は多くの場合、バイオフィルムが遅い性質40に増加しているのだと結合され、細菌細胞の種類、表面の清浄度と影響を受けた人物39の免疫系に依存し、in vitroで39正確に成長することはできません。 oseeointegrationの技術を持つヨーロッパの大腿切断者の調査では、最も頻繁に問題は感染症（頻繁に表面的な感染、1 / 3 periprosthetic感染症）41です明らかに。手術の準備の大幅な改善があった一方で、細菌を根絶するバイオフィルムは、その非プラトニックフォーム34,35,39のために根絶することはより困難500から5000000回の間にあるので、オッセオインテグレーションを向上させるための基本的な要因の一つです。そのため、有害な細菌のコロニーを除去し、骨格固定を増加させるためのモダリティとしての電気刺激を活用することで患者の健康とOIID有効性の保護を確保するための重要な要素です。 ベテランと戦士切断者を使用する利点は、これらの個人の相対的な若者とそうでない場合は良好な健康状態がその積極的なリハビリテーションと経皮のポストのための理想的な人口作ることです外来の補助として役立つだろうと電気刺激のための露出陰極として開発されることがあります。オッセオインテグレーテッドインプラントの存在は、電気部品を挿入するために追加の外科的処置を必要としない、デバイスが外部から制御することが可能と感染42のさらなるリスクを防ぐことができます。そのため、ベテランと戦士切断者の断端への電流注入の方法を理解することによって、10から10 V / cmの大きさの電界がインプラントの界面で、設立に制御して測定することができる。それは、これは骨芽細胞の遊走を誘導し、骨格の添付ファイルを向上させることが可能な、電気の安全なレベルが配信されるようになると仮定される。この程度の電界は、インプラントの界面での骨の量と質を向上させ、加速的リハビリテーションと切断者のための骨格固定の見通しが改善されます。電気刺激の使用は、髄内歯科用インプラントのオッセオインテグレーションを加速するモダリティとして調査し、患者ケアを改善するためにトランスレーショナルリサーチのための多くの機会を提示されていません。 実験結果経皮的電気刺激装置と患者特定のモデルの必要性が研究でサポートされていました。提案された生物医学装置用に開発されたシミュレーションでは、骨芽細胞の遊走を増加させると細菌付着27,34,36,39を防止することにより、骨格の添付ファイルを迅速化の機能を複数持つことができます。コンプutationモデリングが効果的に10から10 V / 2ミリアンペア/ cm 2で 、以下のセンチメートル電界と電流密度が機能的な陰極としてインプラントを使用して生成することができ、最も均一に2つのバンドの外部電極を使用して配布されていることが示されている。人体43に現在の経路を定義することができない。OIIDシステムは、電気的な刺激に関連付けられている古典的な問題を解決するための第一歩かもしれない。したがって、骨格添付ファイルを高めるためのツールを確立することがosseointegrated手続きに必要なリハビリテーションの長さを減らすことを補助することができる。 高齢切断者のための電気刺激を利用することも同様に模索しなければならない重要な側面です。骨量は、骨格の成 ​​長が停止した後に最大十年ですが、8番目と9番目の年間44で大幅に減少する。長骨は年齢とともに変化するにつれ、骨内膜の直径は45を緩める移植につながる可能性のある骨膜直径よりも急速に増加する傾向がある。弱い筋肉から骨への負担の減少と相まって、この問題は、骨粗しょう症や骨減少症45衰弱性疾患に寄与するとosseointegratedインプラントの患者さんのための追加治療の選択肢が必要な場合があります。しかし、制御された電気刺激と機械的負荷は骨ongrowthの相乗触媒として作用し、OIIDシステムを用いて高齢患者を持つホストの骨のベッドの整合性を維持することができる。

bioelectric analyses of an osseointegrated intelligent implant design system for amputees

アメリカの切断者の予測数は、2050年までに360万を増加すると予想されて。これらの個人の多くは、日常的な活動を行うために人工的な手足に依存しますが、従来のソケットの技術を用いて人工懸濁液は、四肢の損失を持つ人のために扱いにくく、不快なことを証明することができます。また、高い近位切断患者のために、限られた断端の長さはすべて一緒にexoprosthesis添付ファイルを防ぐことができます。オッセオインテグレーテッドインプラントの技術は、ホストの骨とインプラントの間に固い骨格添付ファイルを可能にする新たな手術の手順です。 osseointegratedインプラントとヨーロッパの切断者の予備的結果は、骨とインプラントのインタフェースへの負荷の直接転送を可能にすることで、改善された臨床結果を示している。ソケットの技術上のオッセオインテグレーションの見かけ上の利点にもかかわらず、現在の再生手続では、電気刺激を介して迅速な骨格添付ファイルを小さくすることができる前に、制限荷重の長い期間を必要とする。 osseointegratedインテリジェントインプラントの設計（OIID）システムの目的は、骨格の添付ファイルを加速し、periprosthetic感染を防止するための電気システムのインプラントの部分を作ることです。最適な電極のサイズと配置を決定するために、我々は、切断された人残留手足の電気刺激中に発生する電界と電流密度の計算モデルと概念実証を開始した。患者の安全性を確保提供するためには、遡及的コンピュータ断層撮影スキャンの被験者が選択され、三次元再構成は、IRBとHIPAA承認された研究では解剖学的精度（Seg3DとSCIRun）を確保するためにカスタマイズされたソフトウェアプログラムを使用して作成されました。これらのソフトウェアパッケージは、患者の特定のモデルの開発を支持し、電極の位置とサイズのインタラクティブな操作を可能にした。予備的な結果は、電界と電流密度は、骨芽細胞の遊走を誘導する骨格固定を強化し、periprosthetic感染を防ぐことができるために必要な均一な電界分布を達成するためにインプラントの界面で発生することができることを示している。モデルで実験し、電極の構成に基づいて、外部の2つのバンドの構成は、将来的に提唱されます。

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Bioelectric Analyses of an Osseointegrated Intelligent Implant Design System for Amputees

血管閉塞性疾患や外傷に起因する四肢の損失のための代替人工器官の添付ファイルを開発する必要があります。仕事の目標は、骨格の固定を高め、osseointegrated技術を必要とする患者のためのperiprosthetic感染率を減らすためにosseointegratedインテリジェントなインプラント設計システムを導入することである。

切断者のためのOsseointegratedインテリジェントインプラント設計システムの生体電気分析

The projected number of American amputees is expected to rise to 3.6 million by 2050.  Many of these individuals depend on artificial limbs to perform ...

bioelectric-analyses-an-osseointegrated-intelligent-implant-design

Research

JoVE Journal

Biology

13.8K ビュー.  Department of Veteran Affairs. 血管閉塞性疾患や外傷に起因する四肢の損失のための代替人工器官の添付ファイルを開発する必要があります。仕事の目標は、骨格の固定を高め、osseointegrated技術を必要とする患者のためのperiprosthetic感染率を減らすためにosseointegratedインテリジェントなインプラント設計システムを導入することである。

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Evisceration of Mouse Vitreous and Retina for Proteomic Analyses

While the mouse retina has emerged as an important genetic model for inherited retinal disease, the mouse vitreous remains to be explored. The vitreous is a highly aqueous extracellular matrix overlying the retina where intraocular as well as extraocular proteins accumulate during disease.1-3 Abnormal interactions between vitreous and retina underlie several diseases such as retinal detachment, proliferative diabetic retinopathy, uveitis, and proliferative vitreoretinopathy.1,4 The relative mouse vitreous volume is significantly smaller than the human vitreous (Figure 1), since the mouse lens occupies nearly 75% of its eye.5 This has made biochemical studies of mouse vitreous challenging. In this video article, we present a technique to dissect and isolate the mouse vitreous from the retina, which will allow use of transgenic mouse models to more clearly define the role of this extracellular matrix in the development of vitreoretinal diseases.

The dissection technique illustrates evisceration of the vitreous, retina, and lens from the mouse eye, separation by centrifugation, and characterization with protein assays.

プロテオーム解析のためのマウスの硝子体と網膜の内臓摘出

While the mouse retina has emerged as an important genetic model for inherited retinal disease, the mouse vitreous remains to be explored. The vitreous is ...

生物学

Trajectory Data Analyses for Pedestrian Space-time Activity Study

It is well recognized that human movement in the spatial and temporal dimensions has direct influence on disease transmission1-3. An infectious disease typically spreads via contact between infected and susceptible individuals in their overlapped activity spaces. Therefore, daily mobility-activity information can be used as an indicator to measure exposures to risk factors of infection. However, a major difficulty and thus the reason for paucity of studies of infectious disease transmission at the micro scale arise from the lack of detailed individual mobility data. Previously in transportation and tourism research detailed space-time activity data often relied on the time-space diary technique, which requires subjects to actively record their activities in time and space. This is highly demanding for the participants and collaboration from the participants greatly affects the quality of data4.
Modern technologies such as GPS and mobile communications have made possible the automatic collection of trajectory data. The data collected, however, is not ideal for modeling human space-time activities, limited by the accuracies of existing devices. There is also no readily available tool for efficient processing of the data for human behavior study. We present here a suite of methods and an integrated ArcGIS desktop-based visual interface for the pre-processing and spatiotemporal analyses of trajectory data. We provide examples of how such processing may be used to model human space-time activities, especially with error-rich pedestrian trajectory data, that could be useful in public health studies such as infectious disease transmission modeling.
The procedure presented includes pre-processing, trajectory segmentation, activity space characterization, density estimation and visualization, and a few other exploratory analysis methods. Pre-processing is the cleaning of noisy raw trajectory data. We introduce an interactive visual pre-processing interface as well as an automatic module. Trajectory segmentation5 involves the identification of indoor and outdoor parts from pre-processed space-time tracks. Again, both interactive visual segmentation and automatic segmentation are supported. Segmented space-time tracks are then analyzed to derive characteristics of one's activity space such as activity radius etc. Density estimation and visualization are used to examine large amount of trajectory data to model hot spots and interactions. We demonstrate both density surface mapping6 and density volume rendering7. We also include a couple of other exploratory data analyses (EDA) and visualizations tools, such as Google Earth animation support and connection analysis. The suite of analytical as well as visual methods presented in this paper may be applied to any trajectory data for space-time activity studies.

A suite of spatiotemporal processing methods are presented to analyze human trajectory data, such as that collected using a GPS device, for the purpose of modeling pedestrian space-time activities.

歩行者空間·時間·アクティビティ·研究のための軌道データ解析

It is well recognized that human movement in the  spatial and temporal dimensions has direct influence on disease transmission1-3.  An infectious disease ...

Nanogold Labeling of the Yeast Endosomal System for Ultrastructural Analyses

Endosomes are one of the major membrane sorting checkpoints in eukaryotic cells and they regulate recycling or destruction of proteins mostly from the plasma membrane and the Golgi. As a result the endosomal system plays a central role in maintaining cell homeostasis, and mutations in genes belonging to this network of organelles interconnected by vesicular transport, cause severe pathologies including cancer and neurobiological disorders. It is therefore of prime relevance to understand the mechanisms underlying the biogenesis and organization of the endosomal system. The yeast Saccharomyces cerevisiae has been pivotal in this task. To specifically label and analyze at the ultrastructural level the endosomal system of this model organism, we present here a detailed protocol for the positively charged nanogold uptake by spheroplasts followed by the visualization of these particles through a silver enhancement reaction. This method is also a valuable tool for the morphological examination of mutants with defects in endosomal trafficking. Moreover, it is not only applicable for ultrastructural examinations but it can also be combined with immunogold labelings for protein localization investigations.

Yeast, Saccharomyces cerevisiae, has been a key model organism to identify and study genes regulating the biogenesis and functions of the endosomal system. Here we present a detailed protocol for the specific labeling of the endosomal compartments for ultrastructural studies.

超微細構造解析のための酵母エンドソーム系のナノゴールドラベル付け

Endosomes are one of the major membrane sorting checkpoints in eukaryotic cells and they regulate recycling or destruction of proteins mostly from the ...

An Experimental and Bioinformatics Protocol for RNA-seq Analyses of Photoperiodic Diapause in the Asian Tiger Mosquito, Aedes albopictus

Photoperiodic diapause is an important adaptation that allows individuals to escape harsh seasonal environments via a series of physiological changes, most notably developmental arrest and reduced metabolism. Global gene expression profiling via RNA-Seq can provide important insights into the transcriptional mechanisms of photoperiodic diapause. The Asian tiger mosquito, Aedes albopictus, is an outstanding organism for studying the transcriptional bases of diapause due to its ease of rearing, easily induced diapause, and the genomic resources available. This manuscript presents a general experimental workflow for identifying diapause-induced transcriptional differences in A. albopictus. Rearing techniques, conditions necessary to induce diapause and non-diapause development, methods to estimate percent diapause in a population, and RNA extraction and integrity assessment for mosquitoes are documented. A workflow to process RNA-Seq data from Illumina sequencers culminates in a list of differentially expressed genes. The representative results demonstrate that this protocol can be used to effectively identify genes differentially regulated at the transcriptional level in A. albopictus due to photoperiodic differences. With modest adjustments, this workflow can be readily adapted to study the transcriptional bases of diapause or other important life history traits in other mosquitoes.

An Experimental and Bioinformatics Protocol for RNA-seq Analyses of Photoperiodic Diapause in the Asian Tiger Mosquito, Aedes albopictus

RNA-Seq analyses are becoming increasingly important for identifying the molecular underpinnings of adaptive traits in non-model organisms. Here, a protocol to identify differentially expressed genes between diapause and non-diapause Aedes albopictus mosquitoes is described, from mosquito rearing, to RNA sequencing and bioinformatics analyses of RNA-Seq data.

アジアのタイガーモスキートにおける日長休眠のRNA-seqの分析のための実験とバイオインフォマティクス·プロトコル、<em&gt;ヒトスジシマカ</em

Photoperiodic diapause is an important adaptation that allows individuals to escape harsh seasonal environments via a series of physiological changes, ...

Laboratory Protocol for Genetic Gut Content Analyses of Aquatic Macroinvertebrates Using Group-specific rDNA Primers

Analyzing food webs is essential for a better understanding of ecosystems. For example, food web interactions can undergo severe changes caused by the invasion of non-indigenous species. However, an exact identification of field predator-prey interactions is difficult in many cases. These analyses are often based on a visual evaluation of gut content or the analysis of stable isotope ratios (&#948;15N and &#948;13C). Such methods require comprehensive knowledge about, respectively, morphologic diversity or isotopic signature from individual prey organisms, leading to obstacles in the exact identification of prey organisms. Visual gut content analyses especially underestimate soft bodied prey organisms, because maceration, ingestion and digestion of prey organisms make identification of specific species difficult. Hence, polymerase chain reaction (PCR) based strategies, for example the use of group-specific primer sets, provide a powerful tool for the investigation of food web interactions. Here, we describe detailed protocols to investigate the gut contents of macroinvertebrate consumers from the field using group-specific primer sets for nuclear ribosomal deoxyribonucleic acid (rDNA). DNA can be extracted either from whole specimens (in the case of small taxa) or out of gut contents of specimens collected in the field. Presence and functional efficiency of the DNA templates need to be confirmed directly from the tested individual using universal primer sets targeting the respective subunit of DNA. We also demonstrate that consumed prey can be determined further down to species level via PCR with unmodified group-specific primers combined with subsequent single strand conformation polymorphism (SSCP) analyses using polyacrylamide gels. Furthermore, we show that the use of different fluorescent dyes as labels enables parallel screening for DNA fragments of different prey groups from multiple gut content samples via automated fragment analysis.

Most common gut content analyses of macroinvertebrates are visual. Requiring intense knowledge about morphological diversity of prey organisms, they miss soft bodied prey and, due to strong comminution of prey, are nearly impossible for some organisms, including amphipods. We provide detailed, novel genetic approaches for macroinvertebrate prey identification in the diet of amphipods.

水生動物使用グループ固有の rDNA プライマーの遺伝的腸内容分析の研究プロトコル

Analyzing food webs is essential for a better understanding of ecosystems. For example, food web interactions can undergo severe changes caused by the ...

Establishment of an Extracellular Acidic pH Culture System

Conditions of the tumor microenvironment, such as hypoxia or nutrient starvation, play critical roles in cancer progression and malignancy. However, the role of acidic extracellular pH in tumor aggressiveness and its underlying mechanism has not been extensively studied compared to hypoxic or nutrient starvation conditions. In addition, a well-defined culture method to mimic the acidic extracellular tumor microenvironment has not been fully reported.
Here we present a simple in vitro culture method to maintain acidic extracellular pH using reduced bicarbonate and increased lactate or HCl concentrations in the culture medium. The medium pH was sustained for at least 24 h and gradually decreased by 72 h following culture of PANC-1 and AsPC-1 pancreatic cancer cells. Three distinct acidic media conditions in this study highly upregulated pH-responsive genes such as MSMO1, INSIG1, and IDI1 compared to hypoxia or nutrient starvation. The upregulation of these genes can be used as a marker of acidic pH. These simple techniques are beneficial to elucidate underlying mechanisms of tumor malignancy under acidic tumor microenvironment. Therefore, our extracellular acidic pH culture system enables discovery of cellular acidic pH responses not only in cancer cells but also in primary cells, such as renal tubular cells, in relation to the other acidic disorders including, diabetic ketoacidosis, lactic acidosis, renal tubular acidosis, and respiratory acidosis.

The acidic tumor microenvironment plays critical roles in tumor progression. To assess the effects of acidic extracellular pH on cancer cells in vitro, we established simple acidic culture systems.

酸性細胞外 pH 培養系の確立

Conditions of the tumor microenvironment, such as hypoxia or nutrient starvation, play critical roles in cancer progression and malignancy. However, the ...

An Efficient In Vitro Transposition Method by a Transcriptionally Regulated Sleeping Beauty System Packaged into an Integration Defective Lentiviral Vector

The Sleeping Beauty (SB) transposon is a non-viral integrating system with proven efficacy for gene transfer and functional genomics. To optimize the SB transposon machinery, a transcriptionally regulated hyperactive transposase (SB100X) and T2-based transposon are employed. Typically, the transposase and transposon are provided transiently by plasmid transfection and SB100X expression is driven by a constitutive promoter. Here, we describe an efficient method to deliver the SB components to human cells that are resistant to several physical and chemical transfection methods, to control SB100X expression and stably integrate a gene of interest (GOI) through a &#34;cut and paste&#34; SB mechanism. The expression of hyperactive transposase is tightly controlled by the Tet-ON system, widely used to control gene expression since 1992. The gene of interest is flanked by inverted repeats (IR) of the T2 transposon. Both SB components are packaged in integration defective lentiviral vectors transiently produced in HEK293T cells. Human cells, either cell lines or primary cells from human tissue, are in vitro transiently transduced with viral vectors. Upon addition of doxycycline (dox, tetracycline analog) into the culture medium, a fine-tuning of transposase expression is measured and results in a long-lasting integration of the gene of interest in the genome of the treated cells. This method is efficient and applicable to the cell line (e.g., HeLa cells) and primary cells (e.g., human primary keratinocytes), and thus represents a valuable tool for genetic engineering and therapeutic gene transfer.

An Efficient In Vitro Transposition Method by a Transcriptionally Regulated Sleeping Beauty System Packaged into an Integration Defective Lentiviral Vector

This protocol describes a method to achieve stable integration of a gene of interest into the human genome by the transcriptionally regulated Sleeping Beauty system. Preparation of the integration of defective lentiviral vectors, the in vitro transduction of human cells, and the molecular assay on transduced cells are reported.

統合欠陥レンチウイルスベクターにパッケージ化された転写調節睡眠美容システムによって効率的な体外転位法

The Sleeping Beauty (SB) transposon is a non-viral integrating system with proven efficacy for gene transfer and functional genomics. To optimize the SB ...

Tissue Collection of Bats for -Omics Analyses and Primary Cell Culture

As high-throughput sequencing technologies advance, standardized methods for high quality tissue acquisition and preservation allow for the extension of these methods to non-model organisms. A series of protocols to optimize tissue collection from bats has been developed for a series of high-throughput sequencing approaches. Outlined here are protocols for the capture of bats, desired demographics to be collected for each bat, and optimized methods to minimize stress on a bat during tissue collection. Specifically outlined are methods for collecting and treating tissue to obtain (i) DNA for high molecular weight genomic analyses, (ii) RNA for tissue-specific transcriptomes, and (iii) proteins for proteomic-level analyses. Lastly, also outlined is a method to avoid lethal sampling by creating viable primary cell cultures from wing clips. A central motivation of these methods is to maximize the amount of potential molecular and morphological data for each bat and suggest optimal ways to preserve tissues so they retain their value as new methods develop in the future. This standardization has become particularly important as initiatives to sequence chromosome-level, error-free genomes of species across the world have emerged, in which multiple scientific parties are spearheading the sequencing of different taxonomic groups. The protocols outlined herein define the ideal tissue collection and tissue preservation methods for Bat1K, the consortium that is sequencing the genomes of every species of bat.

This is a protocol for the optimal tissue preparation for genomic, transcriptomic, and proteomic analyses of bats caught in the wild. It includes protocols for bat capture and dissection, tissue preservation, and cell culturing of bat tissue.

-オミクス分析と原発細胞培養のためのコウモリの組織採取

As high-throughput sequencing technologies advance, standardized methods for high quality tissue acquisition and preservation allow for the extension of ...

Tobacco Hornworm as an Insect Model System for Cannabinoid Pre-clinical Studies

With increased attention on cannabinoids in medicine, several mammalian model organisms have been used to elucidate their unknown pharmaceutical functions. However, many difficulties remain in mammalian research, which necessitates the development of non-mammalian model organisms for cannabinoid research. The authors suggest the tobacco hornworm Manduca sexta as a novel insect model system. This protocol provides information on preparing the artificial diet with varying amounts of cannabidiol (CBD), setting up a cultivation environment, and monitoring their physiological and behavioral changes in response to CBD treatment. Briefly, upon receiving hornworm eggs, the eggs were allowed 1-3 days at 25 &#176;C on a 12:12 light-dark cycle to hatch before being randomly distributed into control (wheat germ-based artificial diet; AD), vehicle (AD + 0.1% medium-chain triglyceride oil; MCT oil) and treatment groups (AD + 0.1% MCT + 1 mM or 2 mM of CBD). Once the media was prepared, 1st instar larvae were individually placed in a 50 mL test tube with a wooden skewer stick, and then the test tube was covered with a cheesecloth. Measurements were taken in 2-day intervals for physiological and behavioral responses to the CBD administration. This simple cultivation procedure allows researchers to test large specimens in a given experiment. Additionally, the relatively short life cycles enable researchers to study the impact of cannabinoid treatments over multiple generations of a homogenous population, allowing for data to support an experimental design in higher mammalian model organisms.

The present protocol provides instructional information for using tobacco hornworm Manduca sexta in cannabinoid research. The method described here includes all necessary supplies and protocols to monitor physiological and behavioral changes of the insect model in response to cannabidiol (CBD) treatment.

カンナビノイド前臨床試験のための昆虫モデルシステムとしてのタバコホーンワーム

With increased attention on cannabinoids in medicine, several mammalian model organisms have been used to elucidate their unknown pharmaceutical ...

Design and Implementation of a Rat Ex Vivo Lung Perfusion Model

Ex vivo lung preparations are a useful model that can be translated to many different fields of research, complementing corresponding in vivo and in vitro models. Laboratories wishing to use isolated lungs need to be aware of important steps and inherent challenges to establish a setup that is affordable, reliable, and that can be easily adapted to fit the topic of interest. This paper describes a DIY (do it yourself) model for ex vivo rat lung ventilation and perfusion to study drug and gas effects on pulmonary vascular tone, independent of changes in cardiac output. Creating this model includes a) the design and construction of the apparatus, and b) the lung isolation procedure. This model results in a setup that is more cost-effective than commercial alternatives and yet modular enough to adapt to changes in specific research questions. Various obstacles had to be resolved to ensure a consistent model that is capable of being used for a variety of different research topics. Once established, this model has proven to be highly adaptable to different questions and can easily be altered for different fields of study.

Design and Implementation of a Rat Ex Vivo Lung Perfusion Model

Ex vivo lungs are useful for a variety of experiments to collect physiological data while excluding the confounding variables of in vivo experiments. Commercial setups are often expensive and limited in the types of data they can collect. We describe a method for building a fully modular setup, adaptable for various study designs.

ラット Ex Vivo 肺灌流モデルの設計と実装

Ex vivo lung preparations are a useful model that can be translated to many different fields of research, complementing corresponding in vivo and in vitro ...