我々は、博士益君の歌、そして生物学科、助言および助けのためのジョンズホプキンス大学のHattar Kuruvilla趙三研究室のメンバーに感謝。 NIHの助成金DC007395とDC009946によってサポートされています。

パート1。 EOGレコーディングのセットアップ記録装置は、記録電極、参照電極、空気供給管、試料ステージ、および解剖顕微鏡、すべてのファラデーケージ内の空気のテーブルの上にアンカーで構成されています。マイクロマニピュレーターは電極の配置と空気の配信チューブに使用されます。連続的な空気の流れは、空気供給管を通って試料上に渡す前に、湿度を追加するには、蒸留水バブリングされています。 6〜8ミリメートルの深さにSylgardで満たされた60mmの培養皿は、試験片の取付け面として使用されます。よくとチャネルは電気的に変更されたリンゲル液を経由して試料に参照電極を接続するための手段を提供するために取り付け皿にSylgardがくり抜かれている。 記録電極と参照電極は、アンプに接続されています。アンプからの信号がデジタイザにし、コンピュータに送信されます。このようなAxographやpClampなどのソフトウェアは、信号を記録し、そして反応のその後の分析のために、刺激のプロトコルを制御するために使用することができます。 EOG記録時の​​記録電極を配置しながら、アンプの後に接続してオシロスコープには、電位のリアルタイム監視に便利です。 嗅覚刺激の配信は、信号収集に使用したのと同じコンピュータに接続されているPicospritzer、によって制御されます。 Picospritzerでの空気の圧力は10 psiに設定されています。単一の空気タンクとレギュレータは、エアテーブルとPicospritzer両方に空気を供給するために使用することができます。第2空気タンクとレギュレータは、これはより低い圧力と空気の流れを大量に必要とするよう、加湿空気の流れのために空気を提供するために使用されます。匂い刺激を提供する直前に、Picospritzerの出力は、匂いのボトルに接続されています。匂いのボトルは、空気供給管に接続されています。 第2部：準備電極記録電極は、プルアップガラス修正リンゲル溶液（135 mMのNaCl、5mMのKClを、1mMのCaCl 2、1.5mMのMgCl 2、10mMのHEPES、pH7.4の、フィルター滅菌）で満たされたキャピラリー内chlorided銀線です。参照電極はchlorided銀線です。 <ol><li>電極ホルダーに銀線を取り付けます。記録電極の場合は、ワイヤ1〜2センチ電極ホルダーの端から突出してください。より線は、参照電極のために残すことができます。 </li><li>銀線に塩化銀のコートを追加するには、0.1 M NaCl中でワイヤを配置し、1.5から9 V DC電源の正端子に電極ホルダーを接続してください。電源の負端子は電気的に0.1 M NaCl溶液に接続する必要があります。 10分間進行さchloriding反応を可能にする。記録と参照電極との間の静電気を均等化するために、一時的に記録装置にインストールする前に一緒に電極に触れない。 </li><li>マイクロピペットプラーを使用してガラスキャピラリーを引き出します。キャピラリーの先端の開口部は直径5〜10ミクロン前後となるはずです。 </li><li>それは銀線より〜2センチメートル長くなるようにキャピラリーの平滑末端を獲得し、オフブレークするダイヤモンドの鉛筆を使用してください。ブタンのトーチと切断端を火磨く。 </li><li>修正リンゲル溶液に0.5％アガロースを溶かす。トランスファーピペットを用いて電極の先端部に溶融アガロース溶液の少量を引き出します。 </li><li>修正されたリンゲル液（この目的のために有用である加熱と長い細い端を持つように引っ張られているシリンジ）との双方向の約1 / 2プルキャピラリを埋める。ゆっくりと気泡を取り除くために、キャピラリーをフリック。彼らが使用できるようになるまで底で修正されたリンゲル液を少量保存瓶に充填された電極を保管してください。組織サンプルは、準備と録音の準備が完了したら、記録電極線上に塗りつぶされたキャピラリをインストールしてください。 </li></ol>パート3：準備嗅覚ソリューション着臭剤アミルアセテートとheptaldehydeが大きな応答を呼び起こすため、EOG興奮剤として適しています。 <ol><li>マイクロ遠心チューブに、ジメチルスルホキシド（DMSO）の匂いの希釈系列を用意する。用量反応曲線の開始点として、× 10 -6 M、5 Mから5〜10倍希釈液を調製毎日新鮮な希釈を行う。 </li><li>さらにシリコンのストッパー付き2オンスボトルの4.9 MLSの水とDMSO中に100μLの希釈株を混合して水に50倍に付臭剤を希釈する。ソリューションは、少なくとも30分間ボトルで平衡化してみましょう。それぞれのボトルの匂いの蒸気濃度が不明であることに注意してください、しかし液相中の臭気物質の濃度の関数として変化します。 </li><li> pにシリコン栓を介して2台の18ゲージの針を挿入する入力ポートと出力ポートをrovide。ボトルを使用していないときにポートは接続する必要があります。 </li></ol>パート4：EOGを記録し、データを分析する<ol><li>断頭続いてCO 2安楽死または麻酔薬過剰投与により、マウスを生け贄に捧げる。頭蓋骨を覆う皮膚を削除し、sagittally正中線に沿って頭を二等分する。 </li><li>取付け皿に、頭の半分、内側をマウントします。慎重に甲を公開するために隔壁を削除します。 </li><li>記録ステージ上にマウントされているティッシュで皿を置きます。甲介上の記録位置を顕微鏡下で中央になるようにステージの位置を合わせます。 </li><li>鼻甲介の表面に加湿空気を供給する空気タンクをオンにします。位置が離れて記録位置から約10mmになるよう空気供給管を。流速は、約600 mL /分です。 </li><li>ローパス1kHzでフィルター、および100XのゲインとDCモード（ACの増幅は、EOG信号にアーティファクトを誘発する）にアンプを設定します。 </li><li>マイクロマニピュレータの記録と参照電極をマウントします。 </li><li>取り付け皿にウェルに参照電極を下げて、それが電気的に組織に接続されるように変更されたリンゲル液で覆う。 </li><li>鼻甲介第IIbまたはIIIの表面に記録電極を慎重に下ろします。電極は、かろうじて嗅上皮の表面に触れてください！電極は、上皮（すなわち、電気回路を完了する）直線のベースラインとの接触時にオシロスコープに表示されます。 </li><li>空気供給管のサイドポートへの嗅覚ボトルを取り付けます。 </li><li>コンピュータ上で、刺激のプロトコルを開始する。データ取得のためのサンプリングレートは、2 kHz以上でなければなりません。ソフトウェアは、臭気のパルスをトリガし、録音を開始します。 </li><li>典型的な刺激プロトコルは100ミリ秒のパルスが1秒間隔で区切られたペアの100ミリ秒持続時間単パルス、または10秒の持続性の脈があります。 </li><li>組織が最小限に適応されるように、プロトコル間のいくつかの時間を許可します。 1分、最大10 -3 Mの酢酸アミルとheptaldehydeの液体の濃度で十分です。高濃度で5分の時間を要します。高い臭気濃度を配信したあとで（そのような用量 - 反応曲線の終了時など）残留臭気は、チューブ内に残る可能性があります。追加の組織サンプルを続行する前に、95％エタノールとドライでエアチューブを洗浄してください。 </li><li> Axographソフトウェアは、EOG信号の主要パラメータを測定するためのツールが用意されています。このようなパラメータは、応答の振幅、遅延時間、ピークまでの時間、および終了の時定数が含まれています。それはデジタルでさらに分析する前に、25 Hzでトレースをフィルタ処理することが望ましい場合があります。 </li></ol>代表的な結果<img src="/files/ftp_upload/1850/1850fig1.jpg" alt="図1" /> 図1。分析をEOGためのパラメータ。EOGのいくつかのパラメータは、マウスとの間の応答の比較のために特に有用である、応答の振幅、遅延時間（刺激を投与し、応答が開始されるまでの時間）を含めて、立ち上がり時間（開始までの時間レスポンスとピークの）、ピークまでの時間（刺激開始から応答のピークまでの時間）、および終了の時定数（τ、シングル指数方程式に応答の減衰をフィッティングによって決定）。このような待ち時間、立ち上がり時間、および終了の時定数などの動特性パラメータの比較については、それは分析前に応答のピーク振幅を正規化することをお勧めします。 <img src="/files/ftp_upload/1850/1850fig2.jpg" alt="図2" /> 図2。異なる刺激プロトコルの下で代表的なEOG信号。（）マウスからEOGsの例として酢酸アミル濃度の増加による刺激への返信です。パネルの上部にある黒い線は、嗅覚刺激のタイミングと期間を示している。伝説中の濃度は、液体溶液の濃度です。 （b）の用量 - 反応関係は、5匹の平均値。エラーバーは95％の信頼区間です。ピーク振幅の減少は、しばしば非常に高い臭気濃度で観察される。 （C）ペア - パルス刺激に対する応答のEOGの例を。臭気物質の単一の短いパルスは、数秒のための永続的な適応を誘発する。 （d）は10秒に対応してEOGの例では、嗅覚刺激を持続。 EOGは、連続的な匂いのプレゼンテーション中に脱感作を示しています。

<ol>
	<li>Ottoson, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+electrical+activity+of+the+olfactory+epithelium.">Analysis of the electrical activity of the olfactory epithelium.</a> Acta Physiologica Scandinavica. 35, 1-83 (1956).</li><li>Scott, J. W., Scott-Johnson, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+electroolfactogram:+a+review+of+its+history+and+uses.">The electroolfactogram: a review of its history and uses.</a> Microsc Res Tech. 58, 152-160 (2002).</li><li>Brunet, L. J., Gold, G. H., Ngai, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=General+anosmia+caused+by+a+targeted+disruption+of+the+mouse+olfactory+cyclic+nucleotide-gated+cation+channel.">General anosmia caused by a targeted disruption of the mouse olfactory cyclic nucleotide-gated cation channel.</a> Neuron. 17, 681-693 (1996).</li><li>Belluscio, L., Gold, G. H., Nemes, A., Axel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mice+deficient+in+G(olf)+are+anosmic.">Mice deficient in G(olf) are anosmic.</a> Neuron. 20, 69-81 (1998).</li><li>Zhao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+expression+of+a+mammalian+odorant+receptor.">Functional expression of a mammalian odorant receptor.</a> Science. 279, 237-242 (1998).</li><li>Wong, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+the+type+III+adenylyl+cyclase+gene+leads+to+peripheral+and+behavioral+anosmia+in+transgenic+mice.">Disruption of the type III adenylyl cyclase gene leads to peripheral and behavioral anosmia in transgenic mice.</a> Neuron. 27, 487-497 (2000).</li><li>Munger, S. 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D., Zhao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphodiesterase+1C+is+dispensable+for+rapid+response+termination+of+olfactory+sensory+neurons.">Phosphodiesterase 1C is dispensable for rapid response termination of olfactory sensory neurons.</a> Nat Neurosci. 12, 454-462 (2009).</li><li>Kleene, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+electrochemical+basis+of+odor+transduction+in+vertebrate+olfactory+cilia.">The electrochemical basis of odor transduction in vertebrate olfactory cilia.</a> Chem Senses. 33, 839-859 (2008).</li><li>Chen, S., Lane, A. P., Bock, R., Leinders-Zufall, T., Zufall, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blocking+adenylyl+cyclase+inhibits+olfactory+generator+currents+induced+by+"IP(3)-odors".">Blocking adenylyl cyclase inhibits olfactory generator currents induced by "IP(3)-odors".</a> J Neurophysiol. 84, 575-5780 (2000).</li><li>Pinato, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroolfactogram+responses+from+organotypic+cultures+of+the+olfactory+epithelium+from+postnatal+mice.">Electroolfactogram responses from organotypic cultures of the olfactory epithelium from postnatal mice.</a> Chem Senses. 33, 397-404 (2008).</li><li>Ezeh, P. I., Davis, L. M., Scott, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regional+distribution+of+rat+electroolfactogram.">Regional distribution of rat electroolfactogram.</a> J Neurophysiol. 73, 2207-2220 (1995).</li><li>Scott-Johnson, P. E., Blakley, D., Scott, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+air+flow+on+rat+electroolfactogram.">Effects of air flow on rat electroolfactogram.</a> Chem Senses. 25, 761-768 (2000).</li></ol>

マウスは、ジョンズホプキンス大学の動物実験委員会により認可された方法で処理し、安楽死させた。

このプロトコルで説明されている設定で、嗅上皮の表面の匂い刺激は、正確な匂いの濃度とダイナミクスが未知であっても、野生型と変異型マウス間の比較を可能にする、組織の準備の間に一貫性があります。いくつかの要因が、特に録音の場所と加湿空気の流量は、EOGの変動を引き起こす。ケアは、ばらつきを最小限に抑えるために、同じ鼻甲介上に同じような位置から録音に注意する必要があります。これは、簡単に一貫して頭部の同じ側から録音すると、顕微鏡、臭気デリバリーチューブ、および組織サンプルの間に変更されていないエアテーブル上でマニピュレーターのフットプリントを保つことによって達成することができます。さらに、組織サンプルをすぐに組織の過度の乾燥を防ぐために、解剖後に加湿空気流中に配置する必要があります。 マウスでEOG記録は、7、14、15、またはヘッドには手をつけずと甲16、17を超えるドリル小さな穴に電極を挿入してを甲準備マウスで液体灌流装置を用いて実施することができます。 EOG記録の各バリエーションには、独自の強みを持っています：組織標本上で空気相の記録をこのプロトコルで説明するようにセットアップの最小限の量を必要とし、実施するのが最も簡単です。液体灌流装置を使用しての録音は、薬理学的試薬の使用を促進する、ものの多くの匂い物質の疎水性の性質は、臭気の配信を複雑にし、最後に、ヘッドはそのまま残っているこれで録音は&quot;人工的なにおいを嗅ぐ&quot;の実験で使用することができる、電極配置は、甲が完全に露出しているときよりも難しいですが。

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<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Air delivery tube</td>
<td>equipment</td>
<td>Custom fabricated</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>The barrel of a 1-mL syringe with a T-fitting can be used as a substitute</td>
</tr>
<tr>
<td>Air table</td>
<td>equipment</td>
<td>Newport</td>
<td>LW3030B-OPT</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Amplifier</td>
<td>equipment</td>
<td>Warner</td>
<td>DP-301</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Computer and Data Acquisition Software</td>
<td>equipment</td>
<td>Axograph 4.9.2 on Apple Macintosh</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Updated versions of Axograph for Mac OS X and Windows are available from http://axographx.com/.</td>
</tr>
<tr>
<td>Butane torch</td>
<td>equipment</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>A cr&egrave;me br&ucirc;l&egrave;e torch works well</td>
</tr>
<tr>
<td>Digitizer</td>
<td>equipment</td>
<td>Axon Instruments</td>
<td>Digidata 1322A</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dissecting Scope</td>
<td>equipment</td>
<td>Scienscope</td>
<td>SSZ</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Electrode holder</td>
<td>equipment</td>
<td>Harvard Apparatus</td>
<td>64-1021</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Magnetic Holding Devices (12 mm)</td>
<td>equipment</td>
<td>World Precision Instruments</td>
<td>M10</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Micromanipulators</td>
<td>equipment</td>
<td>World Precision Instruments</td>
<td>M3301R M3301L</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Micropipette Puller</td>
<td>equipment</td>
<td>Sutter Instrument Co.</td>
<td>P2000</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Oscilloscope</td>
<td>equipment</td>
<td>Tektronix </td>
<td>5110</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Picospritzer III</td>
<td>equipment</td>
<td>Parker Instrumentation</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Silicone tubing</td>
<td>equipment</td>
<td>Nalge Nunc</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Specimen stage</td>
<td>equipment</td>
<td>Custom fabricated</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Any small solid object can be used to elevate the mounting dish. Immobilize the dish with modeling clay.</td>
</tr>
<tr>
<td>18 gage needles</td>
<td>material</td>
<td>Becton Dickinson</td>
<td>305195</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>2 oz. glass bottles</td>
<td>material</td>
<td>VWR International</td>
<td>16152-201</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glass capillaries</td>
<td>material</td>
<td>World Precision Instruments</td>
<td>TW150F-6</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Silicone stoppers size 16D</td>
<td>material</td>
<td>Chemware</td>
<td>D1069809</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Silver wire</td>
<td>material</td>
<td>World Precision Instruments</td>
<td>AGW1010</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>SylGuard 184</td>
<td>material</td>
<td>Dow Corning </td>
<td>SYLG184</td>
<td>From World Precision Instruments</td>
</tr>
<tr>
<td>Agarose</td>
<td>reagent</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>15510-027</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Amyl acetate</td>
<td>reagent</td>
<td>Aldrich</td>
<td>W504009</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Calcium chloride (CaCl2)</td>
<td>reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>C-1016</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
<td>reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>D5879</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>HEPES</td>
<td>reagent</td>
<td>Fisher</td>
<td>BP310</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Heptaldehyde</td>
<td>reagent</td>
<td>Aldrich</td>
<td>H2120</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2+6H2O)</td>
<td>reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>M9272</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
<td>reagent</td>
<td>JT Baker</td>
<td>3624-05</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>flowmeter</td>
<td>equipment</td>
<td>Gilmont</td>
<td>GF-2260</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

analyzing responses of mouse olfactory sensory neurons using the air-phase electroolfactogram recording

動物はそのような、食料源を見つけるの捕食者を回避し、交配やその他の社会的相互作用のための同種を識別するなど、多くの重要な行動のための嗅覚に依存しています。 electroolfactogram（EOG）記録は、嗅上皮のレベルでのアッセイ嗅覚機能への、有益な実施が容易、かつ信頼性の高い方法です。カエル1のOttosonによるEOG 1956年の記述以来、EOG記録はサンショウウオ、ウサギ、ラット、マウス、およびヒト（スコットとスコットジョンソン、2002、refによってレビューさ2）を含む多くの脊椎動物に適用されています。マウスの遺伝子改変の最近の進歩は、ノックアウトとマウス、ノックの嗅覚機能の生理学的特性評価のためのEOGを記録に関心を再燃している。 EOG録音が正常嗅覚シグナル伝達コンポーネント3-8の中心的役割を示すために、そしてより最近では9月12日 OSNの応答に特定の調節機構の寄与を特徴づけるために適用されている。 匂いの検出は、繊毛に流入し、膜13の脱分極電流を発生、シグナル伝達カスケードは、イオンチャネルの開口につながるOSNs、の繊毛で嗅上皮の表面で発生します。 EOGは、記録のフィールド2内の個々の応答OSNsによって引き起こされる潜在的な変化の和から、その結果、匂い刺激により嗅上皮の表面で細胞外に記録された負電位である。 EOGの振幅と速度の比較は、このように遺伝子改変および他の実験操作は、臭気にOSN応答の根底にある分子のシグナル伝達をどのように影響するかについての貴重な情報を提供しています。 ここでは、マウス嗅覚甲介の準備の空気相のEOGの録音について説明します。簡単に言えば、マウスを犠牲にした後、嗅覚甲介が正中線に沿って頭を二等分し、中隔を除去することによって公開されています。鼻甲介の準備をして、録音の設定で配置され、及び記録電極は内側甲介のいずれかで嗅上皮の表面に配置されます。参照電極は、電気的に緩衝溶液を介して組織に接続されています。加湿空気の連続的な流れは、それが湿った保つために上皮の表面に吹き付けられる。匂いのソリューションの蒸気は、上皮を刺激する加湿空気​​の流れに吹きましたれる。応答が記録され、さらなる分析のためにデジタル化されています。

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Analyzing Responses of Mouse Olfactory Sensory Neurons Using the Air-phase Electroolfactogram Recording

electroolfactogram（EOG）記録は、嗅上皮のレベルでの嗅覚機能を評価するための有益な、簡単に行動し、信頼性の高い方法です。このプロトコルは、録音の設定、マウスの組織の準備、データ収集、および基本的なデータ解析を説明します。

空気相Electroolfactogram記録を用いたマウス嗅覚神経細胞の分析応答

Animals depend on olfaction for many critical behaviors, such as finding food sources, avoiding predators, and identifying conspecifics for mating and ...

analyzing-responses-mouse-olfactory-sensory-neurons-using-air-phase

Research

JoVE Journal

Neuroscience

16.4K ビュー.  Johns Hopkins University. electroolfactogram（EOG）記録は、嗅上皮のレベルでの嗅覚機能を評価するための有益な、簡単に行動し、信頼性の高い方法です。このプロトコルは、録音の設定、マウスの組織の準備、データ収集、および基本的なデータ解析を説明します。

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Lentivirus-mediated Genetic Manipulation and Visualization of Olfactory Sensory Neurons in vivo

Development of a precise olfactory circuit relies on accurate projection of olfactory sensory neuron (OSN) axons to their synaptic 
targets in the olfactory bulb (OB). The molecular mechanisms of OSN axon growth and targeting are not well understood. Manipulating gene expression and subsequent 
visualizing of single OSN axons and their terminal arbor morphology have thus far been challenging. To study gene function at the single cell level within a specified 
time frame, we developed a lentiviral based technique to manipulate gene expression in OSNs in vivo. Lentiviral particles are delivered to OSNs by microinjection 
into the olfactory epithelium (OE). Expression cassettes are then permanently integrated into the genome of transduced OSNs. Green fluorescent protein expression 
identifies infected OSNs and outlines their entire morphology, including the axon terminal arbor. Due to the short turnaround time between microinjection and 
reporter detection, gene function studies can be focused within a very narrow period of development. With this method, we have detected GFP expression within as 
few as three days and as long as three months following injection. We have achieved both over-expression and shRNA mediated knock-down by lentiviral microinjection. 
This method provides detailed morphologies of OSN cell bodies and axons at the single cell level in vivo, and thus allows characterization of candidate gene function 
during olfactory development.

Lentivirus-mediated Genetic Manipulation and Visualization of Olfactory Sensory Neurons in vivo

We present a lentiviral technique for genetic manipulation and visualization of single olfactory sensory neuron axon and its terminal arborization in vivo.

嗅神経細胞のレンチウイルスを介した遺伝子操作と可視化 in vivoで</em

Development of a precise olfactory circuit relies on accurate projection of olfactory sensory neuron (OSN) axons to their synaptic 
targets in the ...

神経科学

Flash Photolysis of Caged Compounds in the Cilia of Olfactory Sensory  Neurons

Photolysis of caged compounds allows the production of rapid and localized increases in the concentration of various physiologically active compounds1. Caged compounds are molecules made physiologically inactive by a chemical cage that can be broken by a flash of ultraviolet light. Here, we show how to obtain patch-clamp recordings combined with photolysis of caged compounds for the study of olfactory transduction in dissociated mouse olfactory sensory neurons. The process of olfactory transduction (Figure 1) takes place in the cilia of olfactory sensory neurons, where odorant binding to receptors leads to the increase of cAMP that opens cyclic nucleotide-gated (CNG) channels2. Ca entry through CNG channels activates Ca-activated Cl channels. We show how to dissociate neurons from the mouse olfactory epithelium3 and how to activate CNG channels or Ca-activated Cl channels by photolysis of caged cAMP4 or caged Ca5. We use a flash lamp6,7 to apply ultraviolet flashes to the ciliary region to uncage cAMP or Ca while patch-clamp recordings are taken to measure the current in the whole-cell voltage-clamp configuration8-11.

Photolysis of caged compounds allows the production of rapid and localized increases in the concentration of various physiologically active compounds. Here, we show how to obtain patch-clamp recordings combined with photolysis of caged cAMP or caged Ca for the study of olfactory transduction in dissociated mouse olfactory sensory neurons.

嗅神経細胞の繊毛のケージド化合物のフラッシュフォトリシス

Photolysis of caged compounds allows the production of rapid and localized increases in the concentration of various physiologically active compounds1. ...

Odorant-induced Responses Recorded from Olfactory Receptor Neurons using the Suction Pipette Technique

Animals sample the odorous environment around them through the chemosensory systems located in the nasal cavity. Chemosensory signals affect complex behaviors such as food choice, predator, conspecific and mate recognition and other socially relevant cues. Olfactory receptor neurons (ORNs) are located in the dorsal part of the nasal cavity embedded in the olfactory epithelium. These bipolar neurons send an axon to the olfactory bulb (see Fig. 1, Reisert &amp; Zhao1, originally published in the Journal of General Physiology) and extend a single dendrite to the epithelial border from where cilia radiate into the mucus that covers the olfactory epithelium. The cilia contain the signal transduction machinery that ultimately leads to excitatory current influx through the ciliary transduction channels, a cyclic nucleotide-gated (CNG) channel and a Ca2+-activated Cl- channel (Fig. 1). The ensuing depolarization triggers action potential generation at the cell body2-4.
In this video we describe the use of the "suction pipette technique" to record odorant-induced responses from ORNs. This method was originally developed to record from rod photoreceptors5 and a variant of this method can be found at jove.com modified to record from mouse cone photoreceptors6. The suction pipette technique was later adapted to also record from ORNs7,8. Briefly, following dissociation of the olfactory epithelium and cell isolation, the entire cell body of an ORN is sucked into the tip of a recording pipette. The dendrite and the cilia remain exposed to the bath solution and thus accessible to solution changes to enable e.g. odorant or pharmacological blocker application. In this configuration, no access to the intracellular environment is gained (no whole-cell voltage clamp) and the intracellular voltage remains free to vary. This allows the simultaneous recording of the slow receptor current that originates at the cilia and fast action potentials fired by the cell body9. The difference in kinetics between these two signals allows them to be separated using different filter settings. This technique can be used on any wild type or knockout mouse or to record selectively from ORNs that also express GFP to label specific subsets of ORNs, e.g. expressing a given odorant receptor or ion channel.

Olfactory receptor neurons (ORNs) convert odor signals first into a receptor current that in turn triggers action potentials that are conveyed to second order neurons in the olfactory bulb. Here we describe the suction pipette technique to record simultaneously the odorant-induced receptor current and action potentials from mouse ORNs.

吸引ピペット技術を用いた嗅覚受容ニューロンから記録匂い物質誘発性応答

Animals sample the odorous environment around them through the chemosensory systems located in the nasal cavity. Chemosensory signals affect complex ...

Intracellular Recording, Sensory Field Mapping, and Culturing Identified Neurons in the Leech, Hirudo medicinalis

The freshwater leech, Hirudo medicinalis, is a versatile model organism that has been used to address scientific questions in the fields of neurophysiology, neuroethology, and developmental biology. The goal of this report is to consolidate experimental techniques from the leech system into a single article that will be of use to physiologists with expertise in other nervous system preparations, or to biology students with little or no electrophysiology experience. We demonstrate how to dissect the leech for recording intracellularly from identified neural circuits in the ganglion. Next we show how individual cells of known function can be removed from the ganglion to be cultured in a Petri dish, and how to record from those neurons in culture. Then we demonstrate how to prepare a patch of innervated skin to be used for mapping sensory or motor fields. These leech preparations are still widely used to address basic electrical properties of neural networks, behavior, synaptogenesis, and development. They are also an appropriate training module for neuroscience or physiology teaching laboratories.

Intracellular Recording, Sensory Field Mapping, and Culturing Identified Neurons in the Leech, Hirudo medicinalis

This article describes three nervous system preparations using leeches: intracellular recording from neurons in ventral ganglia, culturing neurons from ventral ganglia, and recording from a patch of innervated skin to map sensory fields.

細胞内記録、感覚野のマッピング、および培養は、リーチのニューロンを同定しヒルドmedicinalis</i

The freshwater leech, Hirudo medicinalis, is a versatile model organism that has been used to address scientific questions in the fields of ...

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this information to the brain. As such, determining how olfactory information is transferred to the brain, modifying both perception and behavior, merits investigation. Interestingly, there is emerging evidence that cellular transduction and transcriptional factors are involved in the diversification of olfactory receptor neuron. Here we provide a robust whole mount immunological labeling method to assay in vivo olfactory receptor neuron organization. Using this method, we identified all olfactory receptor neurons with anti-ELAV antibody, a known pan-neural marker and Or49a-mCD8::GFP, an olfactory receptor neuron specifically expressed in Nba neuron using anti-GFP antibody.

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Herein we describe the process of whole mount immunostaining of Drosophila antennae, which enables us to better understand the molecular mechanisms involved in the diversification of olfactory receptor neurons (ORN)s.

における嗅覚受容ニューロンのホールマウント免疫標識<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;アンテナ

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this ...

Recording Light-evoked Postsynaptic Responses in Neurons in Dark-adapted, Mouse Retinal Slice Preparations Using Patch Clamp Techniques

The retina is the gateway to the visual system. To understand visual signal processing mechanisms, we investigate retinal neural network functions. Retinal neurons in the network comprise of numerous subtypes. More than 10 subtypes of bipolar cells, ganglion cells, and amacrine cells have been identified by morphological studies. Multiple subtypes of retinal neurons are thought to encode distinct features of visual signaling, such as motion and color, and form multiple neural pathways. However, the functional roles of each neuron in visual signal processing are not fully understood. The patch clamp method is useful to address this fundamental question. Here, a protocol to record light-evoked synaptic responses in mouse retinal neurons using patch clamp recordings in dark-adapted conditions is provided. The mouse eyes are dark-adapted O/N, and retinal slice preparations are dissected in a dark room using infrared illumination and viewers. Infrared light does not activate mouse photoreceptors and thus preserves their light responsiveness. Patch clamp is used to record light-evoked responses in retinal neurons. A fluorescent dye is injected during recordings to characterize neuronal morphological subtypes. This procedure enables us to determine the physiological functions of each neuron in the mouse retina.

We will demonstrate how to prepare retinal slices from the mouse eye and record light responses in retinal neurons. The entire procedure is conducted in dark-adapted conditions.

パッチクランプ技術を用いたダーク適応、マウス網膜スライス標本におけるニューロンにおける記録光誘発シナプス後応答

The retina is the gateway to the visual system. To understand visual signal processing mechanisms, we investigate retinal neural network functions. ...

Perforated Patch-clamp Recording of Mouse Olfactory Sensory Neurons in Intact Neuroepithelium: Functional Analysis of Neurons Expressing an Identified Odorant Receptor

Analyzing the physiological responses of olfactory sensory neurons (OSN) when stimulated with specific ligands is critical to understand the basis of olfactory-driven behaviors and their modulation. These coding properties depend heavily on the initial interaction between odor molecules and the olfactory receptor (OR) expressed in the OSNs. The identity, specificity and ligand spectrum of the expressed OR are critical. The probability to find the ligand of the OR expressed in an OSN chosen randomly within the epithelium is very low. To address this challenge, this protocol uses genetically tagged mice expressing the fluorescent protein GFP under the control of the promoter of defined ORs. OSNs are located in a tight and organized epithelium lining the nasal cavity, with neighboring cells influencing their maturation and function. Here we describe a method to isolate an intact olfactory epithelium and record through patch-clamp recordings the properties of OSNs expressing defined odorant receptors. The protocol allows one to characterize OSN membrane properties while keeping the influence of the neighboring tissue. Analysis of patch-clamp results yields&#160;a precise quantification of ligand/OR interactions, transduction pathways and pharmacology, OSNs&#39; coding properties and their modulation at the membrane level.&#160;

Analyzing the physiological properties of olfactory sensory neurons still faces technical limitations. Here we record them through perforated patch-clamp in an intact preparation of the olfactory epithelium in gene-targeted mice. This technique allows the characterization of membrane properties and responses to specific ligands of neurons expressing defined olfactory receptors.

無傷の神経上皮におけるマウス嗅細胞の穿孔パッチクランプ記録：同定された嗅覚受容体を発現するニューロンの機能解析

Analyzing the physiological responses of olfactory sensory neurons (OSN) when stimulated with specific ligands is critical to understand the basis of ...

Using Single Sensillum Recording to Detect Olfactory Neuron Responses of Bed Bugs to Semiochemicals

The insect olfactory system plays an important role in detecting semiochemicals in the environment. In particular, the antennal sensilla which house single or multiple neurons inside, are considered to make the major contribution in responding to the chemical stimuli. By directly recording action potential in the olfactory sensillum after exposure to stimuli, single sensillum recording (SSR) technique provides a powerful approach for investigating the neural responses of insects to chemical stimuli. For the bed bug, which is a notorious human parasite, multiple types of olfactory sensillum have been characterized. In this study, we demonstrated neural responses of bed bug olfactory sensilla to two chemical stimuli and the dose-dependent responses to one of them using the SSR method. This approach enables researchers to conduct early screening for individual chemical stimuli on the bed bug olfactory sensilla, which would provide valuable information for the development of new bed bug attractants or repellents and benefits the bed bug control efforts.

Bed bugs rely on olfactory receptor neurons housed in their antennal olfactory sensilla to detect semiochemicals in the environment. Utilizing single sensillum recording, we demonstrate a method to evaluate bed bug response to semiochemicals and explore the coding process involved.

情報化学物質にトコジラミの嗅覚ニューロンの応答を検出するために単一感覚子録音を使用しました

The insect olfactory system plays an important role in detecting semiochemicals in the environment. In particular, the antennal sensilla which house ...

Olfactory Behaviors Assayed by Computer Tracking Of Drosophila in a Four-quadrant Olfactometer

A key challenge in neurobiology is to understand how neural circuits function to guide appropriate animal behaviors. Drosophila melanogaster is an excellent model system for such investigations due to its complex behaviors, powerful genetic techniques, and compact nervous system. Laboratory behavioral assays have long been used with Drosophila to simulate properties of the natural environment and study the neural mechanisms underlying the corresponding behaviors (e.g. phototaxis, chemotaxis, sensory learning and memory)1-3. With the recent availability of large collections of transgenic Drosophila lines that label specific neural subsets, behavioral assays have taken on a prominent role to link neurons with behaviors4-11. Versatile and reproducible paradigms, together with the underlying computational routines for data analysis, are indispensable for rapid tests of candidate fly lines with various genotypes. Particularly useful are setups that are flexible in the number of animals tested, duration of experiments and nature of presented stimuli. The assay of choice should also generate reproducible data that is easy to acquire and analyze. Here, we present a detailed description of a system and protocol for assaying behavioral responses of Drosophila flies in a large four-field arena. The setup is used here to assay responses of flies to a single olfactory stimulus; however, the same setup may be modified to test multiple olfactory, visual or optogenetic stimuli, or a combination of these. The olfactometer setup records the activity of fly populations responding to odors, and computational analytical methods are applied to quantify fly behaviors. The collected data are analyzed to get a quick read-out of an experimental run, which is essential for efficient data collection and the optimization of experimental conditions.

Olfactory Behaviors Assayed by Computer Tracking Of Drosophila in a Four-quadrant Olfactometer

We describe here a behavioral setup and data analysis method for assaying olfactory responses of up to 100 vinegar flies (Drosophila melanogaster). This system may be used with single or multiple olfactory stimuli, and adaptable for optogenetic activation or silencing of neuronal subsets.

のコンピュータ追跡することによってアッセイ嗅覚行動<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt; 4象限オルファクトメーターで

A key challenge in neurobiology is to understand how neural circuits function to guide appropriate animal behaviors. Drosophila melanogaster is an ...

Quadruple Immunostaining of the Olfactory Bulb for Visualization of Olfactory Sensory Axon Molecular Identity Codes

The mouse olfactory system is often used to study mechanisms of neural circuit formation&#12288;because of its simple anatomical structure. An Olfactory Sensory Neuron (OSN) is a bipolar cell with a single dendrite and a single unbranched axon. An OSN expresses only one Olfactory Receptor (OR) gene, OSNs expressing a given type of OR converge their axons to a few sets of invariant glomeruli in the Olfactory Bulb (OB). A remarkable feature of OSN projection is that the expressed ORs play instructive roles in axonal projection. ORs regulate the expression of multiple axon-sorting molecules and generate the combinatorial molecular code of axon-sorting molecules at the OSN axon termini. Thus, to understand the molecular mechanisms of OR-specific axon guidance mechanisms, it is vital to characterize their expression profiles at the OSN axon termini within the same glomerulus. The aim of this article was to introduce methods for collecting as many glomeruli as possible on a single OB section and for performing immunostaining using multiple antibodies. This would allow the comparison and analysis of the expression patterns of axon-sorting molecules without staining variation between OB sections.

Olfactory sensory neurons express a wide variety of axon-sorting molecules to establish proper neural circuitry. This protocol describes an immunohistochemical staining method to visualize combinatorial expressions of axon-sorting molecules at the axon termini of olfactory sensory neurons.

嗅覚神経軸索分子識別コードの視覚化のための嗅球の四重免疫染色

The mouse olfactory system is often used to study mechanisms of neural circuit formation&#12288;because of its simple anatomical structure. An Olfactory ...