はじめに、143Bヒト骨肉腫細胞を6ウェルプレートに播種します。細胞が75%コンフルエントになったら、各ウェルの培地を10ミリモルの13C4アスパラギン酸を含む培地と交換し、8時間インキュベートして細胞を標識するための定常状態を実現します。代謝物を単離するには、調製したバッファーをマイナス80°Cで一晩冷却するか、ドライアイスの上に置きます。
その間、インキュベーターからプレートを取り出し、ピペットを使用して各ウェルから培地を吸引します。PBSで2回洗浄し、残っているPBSを取り除いてから先に進みます。次に、プレートをドライアイスの上に置き、各ウェルに800マイクロリットルの準備したバッファーを追加します。
細胞溶解を促進するために、プレートをマイナス80°Cで15分間インキュベートします。インキュベーション後、セルリフターを使用してドライアイス上で各ウェルをこすり落とし、ドライアイス上に置かれた15ミリリットルのマイクロ遠心チューブにライセートを移します。ライセートを摂氏4度で10分間ボルテックスし、それを摂氏4度および17, 000 gで10分間遠心分離する。
次に、上清を1.5ミリリットルのマイクロ遠心チューブに移し、コールドトラップ付きの摂氏4度の真空濃縮器で高真空下で約6時間乾燥させます。乾燥した代謝物ペレットは、さらに使用するまで摂氏マイナス80度で保管してください。.液体クロマトグラフィー質量分析またはLCMSを使用してサンプルを分析するには、示されているように、乾燥したペレットとボルテックスに100マイクロリットルのHPLCグレードの水を追加します。
サンプルを摂氏4度で最高速度で10分間遠心分離します。次に、25マイクロリットルの上清をLCMSバイアルに移し、2マイクロリットルをLCMSシステムに注入します。液体クロマトグラフィーを行うには、移動相Bのグラジエントモードで毎分0.15ミリリットルの一定流量を使用し、80〜20%で20分間、20〜80%で0.5分間、移動相Aに対して80%で7.5分間保持します。 次に、mz 70から1までのフルスキャンを選択して質量分析を実行します。 000ダルトン。
そして70、000の決断。AGC ターゲットを 10 の 1 倍から 6 番目に設定し、最大射出時間を 20 ミリ秒に設定します。次に、実行時間を 16.5 分に設定します。
極性を正に設定します。AGC ターゲットを 1 の 5 乗に設定します。最大 IT は 20 ミリ秒に設定されます。
スキャン範囲は70〜1, 000質量電荷比に設定します。次に、スプレー電圧を3.0キロボルトに設定します。そして、摂氏275度で加熱された毛細管。
シースガス流量を40単位、補助ガス流量を15ユニット、掃引ガス流量を1ユニットで選択します。13C5グルタミン同位体追跡では、細胞が75%コンフルエントに達したら、培地を2ミリモルの13C5グルタミン含有培地に変更し、インキュベートして目的の細胞を標識する定常状態を実現します。以前に実証されたように代謝物を分離して分析します。.
代謝物を単離して分析した後、13C3フマル酸塩、13C4フマル酸塩、13C3コハク酸塩、および13C4コハク酸塩の標識率を計算することにより、コハク酸デヒドロゲナーゼまたはSDH活性を分析します。次に、式を使用してコハク酸酸化とフマル酸還元を評価します。ビヒクル処理条件では、SDH複合体は前方活性に有利であり、13C4コハク酸塩の13C4フマル酸塩への取り込みは、13C3フマル酸塩の13C3コハク酸塩への取り込みよりも高かった。
抗ミシン処理骨肉腫細胞では、SDH複合体は逆の活性を支持し、13C3コハク酸塩への13C3フマル酸塩の取り込みは、13C4コハク酸塩から13C4フマル酸塩への取り込みよりも有意でした。
