まず、リポフスチンを装填したRPE培養液で固定トランスウェルを採取します。培養物をPBSで5回洗浄した後、頂端室に少量のPBSを残す。トランスウェルを解剖顕微鏡下で逆さまに置きます。
かみそりの刃を用いて、膜とトランスウェルの接合部に切削力を加えることにより、トランスウェルから半多孔膜を切り出す。トランスウェル膜が切断されたら、鉗子を使用して顕微鏡スライド上に置きます。細胞に触れないようにしながら、タスクワイプで余分なPBSを拭き取ります。
封入剤を追加し、続いてカバースリップを追加します。トランスウェルのどちら側が正しいかを追跡してください。次に、蛍光色素を用いて目的の抗原を検出し、ピーク励起は488ナノメートル付近、発光検出は500〜530ナノメートルです。
405ナノメートルの励起と585〜635ナノメートルの発光で、自己蛍光検出用に別のチャネルを設定します。OxOSによって誘導された自己蛍光顆粒は、5回の給餌と比較して、20回の給餌後により多くの蓄積を示しました。レシオメトリックイメージングは、Alexa 488で標識されたLC3からUAM自家蛍光を解読するのに役立ちました。
赤チャンネルには難消化性の自家蛍光物質のみが含まれており、LC3シグナルをグリーンチャンネルから分離するのに役立ちました。
