蛍光測定用のすべての取得セットアップコンポーネントをオンにします。解離した筋線維を含む35ミリメートルのガラス底皿を顕微鏡のステージに置きます。1, 000マイクロリットルのピペットで培養液を慎重に取り出し、2ミリリットルの室温リンガー溶液と交換します。
機械式または電動マニピュレーターを使用して、2本のプラチナワイヤーを皿の底に垂直に置きます。電極端子がファイバーの長手方向軸に対して位置合わせされ、ファイバーの端から数ミリメートル離れていることを確認します。独立したマイクロマニピュレーターに取り付けられている場合は、ディッシュを回転させるか、各電極を動かして、電極の位置を調整します。
透過光をオンにし、20倍の対物レンズを使用して視野内のファイバーを見つけます。EGFPフィルターキューブを光路に移動します。透過光をオフにした後、リモコンのライトシャッターを使用して488ナノメートルの励起光をアクティブにします。
EGFP陽性の線維を識別するには、最も明るいEGFPシグナルを有する線維を視野の中央に中央に配置する。励起光路に配置されたダイアフラムを使用して、ファイバの特定の領域に励起光を集束させます。これにより、EGFP CaV1.1信号が最大となる信号取得が可能になります。
メカニカルステージでファイバーの位置を調整してダイアフラムの光路に合わせ、ファイバーのXY位置を保存します。最初に保存したローカリゼーションに戻った後、2つの連続した刺激パルスの持続時間を1ミリ秒に、振幅を20ボルトに、パルスの極性を交互に設定します。次に、手動トリガスイッチを使用して、2つの連続パルスを供給します。
刺激中、反対極性の2つのパルスに応答して、2つの同心円状の均質な線維収縮を観察します。交互の極性パルスで収縮がないか、同心円状の収縮が1つだけ観察される場合は、実験の残りの部分からファイバーを廃棄します。2マイクロリットルの10ミリモルMTS 5 TAMRA溶液を皿に直接加え、1, 000マイクロリットルのピペットで穏やかに混合する。
4〜5分間インキュベートして、蛍光チオール分子を横尿細管系内腔に拡散させます。フィールド刺激を介して、バイポーラ反復刺激を適用して、50ヘルツの速度で300ミリ秒間、1秒ごとに5分間連続した活動電位列車を呼び起こします。1, 000マイクロリットルのピペットで皿から染色液を取り除きます。
そしてそれを2ミリリットルの室温リンガー溶液と交換してください。染色された繊維を染色プロトコルから少なくとも10分間回復させます。2つの交互パルスでファイバーの健全性と電気的活動を再評価した後、MTS 5 TAMRAフィルターキューブを光路に移動し、リモートコントロールのライトシャッターで533ナノメートルの励起光をアクティブにして、ファイバーの汚れを視覚的に確認します。
次に、電動ステージの保管場所を使用して、MTS 5 TAMRAフィルターキューブ、ダイアフラム、および60倍油浸対物レンズを使用して、フィールドの中央にファイバーを配置します。ファイバの両端で電界刺激白金ワイヤの向きを変えた後、ワイヤをファイバの主軸上に直線的に揃え、ファイバを中央にして5ミリメートル離します。集録ソフトウェアで、集録に使用するプロトコルを選択します。
このステップはコンピュータでのみ制御され、電気刺激と光路シャッター制御のためにすべてのダウンストリームデバイスをトリガーします。各プロトコルについて、信号の白化を避けるために総取得時間を可能な限り最小限に抑えるが、ベースラインを記録するための最初の電気刺激の前に数十ミリ秒の光照明および信号取得を可能にする。[実行]を押してプロトコルを実行します。
録音された信号は自動的に画面に表示されます。信号の振幅が小さく、ファイバが機械的に急速に収縮するため、信号の大部分が隠されることが多く、動きのアーチファクトが表示されます。1マイクロモルの100ミリモルとベンゾイルパラトルエンスルホンアミドを記録溶液に加えて、契約上の応答を最小限に抑え、ファイバーの活性化によるS4の動きから生じる信号をさらに区別します。
数分後、同じプロトコルをもう一度実行します。動きのアーチファクトは取り除かれましたが、S4の動きに対応する小さな蛍光の変化が残っています。メカニカルステージを使用して皿を少し動かし、繊維や破片のない領域から信号を取得します。
プロトコルを最後に実行して、バックグラウンド蛍光を記録します。トレースをエクスポートし、スプレッドシートプログラムを使用して信号を時間の関数としてf 0上のデルタfとして表現し、必要に応じてベースライン補正を適用します。EGFP CaV1.1コンストラクトを発現する解剖された筋と解離していない筋の透過画像と蛍光画像の例をここに示します。
MTS 5 TAMRA染色前後のEGFP CaV1.1 VS D3コンストラクトを発現する筋線維の代表的な画像をこの図に示す。この色素は、トランスフェクションされていない繊維の内因性システインも染色します。EGFP CaV1.1 VS D3コンストラクトおよびMTS 5 TAMRA染色の共焦点画像は、筋線維の横尿細管系におけるCaV1.1局在に特徴的なダブルバンドパターンを示しています。
フォトダイオードで測定した2つの刺激に応答した代表的な蛍光記録をここに示します。両方の信号は最小値で正規化され、それぞれの脱分極に対する時間の関数としてプロットされます。これらの記録は、信号の上昇位相とピークまでの時間が、ファイバに課せられた両方の脱分極で類似していることを示しています。
