サンプル調製を開始するには、鋭利なかみそりの刃を使用して、薬理学的に処理されたシロイヌナズナトランスジェニックサンプルから本葉を解剖します。真葉をスライドガラスの上に置き、軸側を上にして水滴を入れます。気泡のないカバースリップで本物の葉をゆっくりと覆います。
イメージングには、黄色蛍光タンパク質またはYFP励起用の514ナノメートルレーザーを選択してビームパスを設定します。高いレーザー出力を使用して高画質を取得します。PMTまたはHYDをオンにして、YFP蛍光色素のスペクトルに基づいて発光バンドの上限と下限の閾値を定義します。
YFP信号を収集するために、530〜570ナノメートルの検出ウィンドウを設定します。2番目の色の連続した画像については、シークボタンをクリックして新しいチャンネルを追加します。シーク2では、赤色蛍光タンパク質またはRFP励起に555ナノメートルのレーザーを選択し、RFP信号を収集するために570〜630ナノメートルの検出ウィンドウを設定します。
気孔前駆細胞内の細胞内膜交通活動をイメージングするために、システム上の63X、1.2Wコアレンズを選択します。1024 x 1024ピクセルの画像サイズでフォーマットを開始し、ズーム係数と目的設定に基づいて最適化して、適切な解像度を実現します。次に、スキャンヘッドの速度を400ヘルツの速度から設定し、サンプルの特定の状況に基づいてこれを最適化します。
対物レンズを変更せずに関心領域をズームするには、ズーム係数に 1 を入力し、実験の特定のニーズに基づいてこれを最適化します。ライン平均とは、平均結果を得るために各Xラインをスキャンする回数を指します。メンブレン輸送イベントのイメージング用に2倍のライン平均から始めて、必要に応じて最適化します。
集録モードでXYTスキャンモードを選択して、時系列ユーティリティを有効にします。次に、時間間隔の下で時間ポイント間の待機期間を選択します。フレームを選択して、収集するフレーム数を定義します。
最大強度投影でZスタックスキャンモードを使用して、細胞全体の膜輸送イベントに関する3次元情報を収集します。次に、取得モードでXYZスキャンモードを選択すると、Zスタックユーティリティにアクセスできるようになります。[Z 幅] オプションを選択します。
スキャンモードで、開始ボタンと終了ボタンを使用して、Z スタックの上部と下部の画像を定義します。次に、ZステップサイズをクリックしてZステップの厚さを定義します。画像を処理するには、共焦点ソフトウェアのプライマリプロセスタブをクリックします。
左端の開いているプロジェクトタブで、関心のあるZスタックファイルを選択します。次に、プロセスツールという名前の中央のタブで、投影関数を選択します。メソッドのドロップダウンパネルで最大を選択し、適用ボタンをクリックします。
開いているプロジェクトタブの下にZスタック投影画像が生成されます。時系列画像からビデオを生成するには、フィジーソフトウェアの[ファイル]タブをクリックし、すべての時系列画像を正しい順序で1つずつ開く機能を開きます。または、画像を画像Jにドラッグして、正しい順序でデータを開きます。
次に、画像タブでスタック関数を見つけ、スタックする画像を選択してビデオを生成します。完了したら、ファイルをavi形式で目的のフレームレートで保存します。ERL1プロモーターERL1 YFPを有する7日齢のトランスジェニック植物の本葉では、ERL1 YFPが原形質膜を標識したYFPシグナルによって散在細胞が強調表示されました。
複数の点状シグナルも観察され、ERL1もエンドソームに局在していることが示唆されました。RFP Ara7は、ほぼすべての細胞で複数の点状シグナルを強調し、これらの細胞の多胞体(MVB)を示しました。RFP Ara7がERL1 YFPシグナルと融合したとき、ほとんどの点状物が重なり合っており、一部のERL1 YFP分子がMVBに輸送されたことが示唆されています。
ERL1、YFP、MVBマーカータンパク質RFP Ara7を有する本葉の時系列は、YFP標識エンドソームが気孔系譜細胞内でRFP Ara7とともに移動したことを示した。ERL1 YFPが多胞体に局在することを確認した。
