まず、エレクトロポレーション線維芽細胞のプレートを取り、10倍から20倍の対物レンズ位相差顕微鏡でhiPSCコロニーの形成を観察します。直径300マイクロメートル、明確な境界、および高い核対体比を持つhiPSCコロニーは、ピッキングに適しています。ピッキングする前に、hiPS細胞培養に適した96ウェルプレートのウェルを100マイクロリットルのコーティング溶液でコーティングします。
そして摂氏37度で1時間インキュベートします。インキュベーション中に、細胞培養皿の底にある目的のコロニーをペンでマークします。96ウェルプレートの最終調製のために、コーティング溶液を取り出し、10マイクロモルのROCK阻害剤Y-27632を含む100マイクロリットルの予め温めたhiPSc培養培地を各ウェルに加えます。
次に、予め温めたPBSで細胞を洗浄し、10マイクロモルのROCK阻害剤Y-27632を含む新鮮な予め温めたhiPSc培養液を加えてから、死細胞を除去します。ゲージ針を使用してhiPSCコロニーをピックし、各コロニーにグリッドを描画してコロニーを小片に分割します。その後、位相差顕微鏡を使用して、コロニーが細かく分割されていることを確認します。
最後に、100マイクロリットルのピペットでコロニーを調製した96ウェルプレートに移し、ピペットをコロニーの上に直立させます。細胞を摂氏37度と5%二酸化炭素で一晩乱すことなく付着させます。翌日、培地を200マイクロリットルの新鮮なhiPS細胞培養培地と交換してROCK阻害剤Y-27632を除去し、プレートをインキュベーターに戻します。
96ウェルプレートを監視し、正常にピックされたクローンでウェルに印を付けます。マークされたクローンは、この時点で展開および凍結できます。位相差画像は、hiPSCコロニーの再プログラムに成功しており、選択されたhiPSC、自発分化コロニー、非hiPSCコロニー、および密度が高すぎるhiPSc培養が提示されています。
