Mouse Retina Isolation and Flattening

安楽死させたマウスの眼球を固定した後、スライドガラスに移し、解剖顕微鏡の下に置く。鉗子を使用して、眼球の動きを防ぐために角膜の縁を固定します。解剖ハサミで角膜強膜辺部を通して角膜周囲を約1mmの深さで切断し、水晶体と硝子体を取り除きます。

視神経乳頭を中央に保持し、網膜を4つの象限に沿って放射状に切断し、網膜の半径の約2/3に達します。歯付き鉗子を使用して強膜エッジの1つをクランプします。歯のない鉗子で強膜の端を持ち、歯のある鉗子から強膜基部に向かって移動します。

網膜を慎重に剥がします。ピペットを使用して200マイクロリットルのPBSで網膜を濡らします。吸収紙を使用して余分なPBSを取り除き、必要に応じて小さな毛ブラシで網膜を平らにします。

冷たいメタノールを網膜の内面に完全に覆われるまでゆっくりと滴下します。網膜が白くなり、粘り強さが増したら、網膜をそっと平らにし、小さな毛ブラシで残留色素膜や硝子体などの不純物を取り除きます。網膜を反転させた後、前述のようにメタノールで処理し、24ウェルプレートのウェルに移し、メタノールに浸し、摂氏20度で1〜2時間保存して、即時の免疫染色を行います。

次に、プレートからメタノールを除去した後、PBSで網膜をすすぎます。メタノール処理前後の網膜のレチノール神経節細胞を共焦点顕微鏡で可視化し,12カ月間のメタノール保存はRGC免疫染色に影響しないことが示された。