Anopheles Mosquito Testis Dissection and Hybridisation

ハマダラカの蛹から少なくとも20個の精巣を無菌PBSで切除することから始めます。精巣をPBSの新鮮な滴を含む清潔な顕微鏡スライドに移します。P1000板入りのろ過チップまたは解剖針の先端を使用して、PBSTに3.7%ホルムアルデヒドを含む胚皿に精巣を移します。

室温で10分間インキュベートします。次に、PBSTで室温で5分間精巣を洗浄します。精巣をRNase Aを含む胚皿に移し、摂氏37度で30分間インキュベートします。

RNA溶液を除去し、1ミリリットルの浸透溶液を加えます。精巣を浸透溶液中で室温で10分間インキュベートします。次に、精巣とPBSTをそれぞれ5分間、2回洗浄します。

標識されたDNAプローブと20〜30マイクロリットルのハイブリダイゼーション溶液を含む1.5ミリリットルのチューブに精巣を移します。混合物を暗所で摂氏37度で一晩インキュベートし、ハイブリダイゼーションを可能にします。AP 1000ホワイトボアフィルターチップの助けを借りて、精巣を胚皿に移し、2つのXSSCで5分間洗浄します。

SSCを取り外し、DAPIを含む市販の封入剤を使用して、曇りガラスのスライドに精巣を取り付けます。スライドをカバースリップシーラントで密封し、室温で暗所で2時間インキュベートします。良好なレベルのハイブリダイゼーションにより、精子形成全体を通して標的染色体を可視化することができました。

標識された性染色体のペアリングは、プレバイオティクスとミオティックの段階で見られました。XまたはYの精子は、精子形成全体を通して追跡することができ、さまざまなレベルのDNA凝縮によって特徴付けられ、矢印の形をした成熟精子の最終段階まで追跡できます。