Testing the Polarized State of Mitochondria to Analyze the Ion Channel Function in Cancer Cells

まず、75平方センチメートルの培養フラスコで細胞を維持します。培養液を吸引し、カルシウムとマグネシウムを含まないPBSで細胞をすすぎます。次に、2ミリリットルの0.25%トリプシンEDTAを加えて接着細胞を剥離します。

室温で5分間インキュベートし、細胞を10ミリリットルの培地に再懸濁します。次に、フラスコから細胞を15ミリリットルの遠沈管に集めます。480 Gで室温で5分間遠心分離し、培地を吸引します。

培養物の元のコンフルエント性に基づいて、細胞を5〜10ミリリットルの培地に再懸濁します。100マイクロリットルの細胞を取り除き、100マイクロリットルの0.4%トリパンブルーを入れた1.5ミリリットルのチューブに加えます。細胞を血球計算盤に加え、顕微鏡で観察し、手動タリーカウンターを使用してカウントします。

細胞をフェノールレッドを含まない培養液で1ミリリットルあたり10〜4個の細胞に3倍に希釈する。メーカーの指示に従って、ポリ-D-リジンでコーティングされたカバースリップを備えた6ウェルプレートの各ウェルに2.5ミリリットルの細胞懸濁液を追加します。加湿インキュベーターで摂氏37度、二酸化炭素5%で一晩細胞を増殖させ、カバースリップへの細胞付着を可能にします。

翌日、20倍の対物レンズを用いて倒立顕微鏡で細胞の付着を調べます。処理原液を所望の濃度で調製し、培地のみのコントロール、試験化合物に一致する濃度のビヒクルのみの対照、およびイオノフォアFCCPと試験化合物を有する対照を作成します。一度に1枚のカバースリップを使用して、研究中の状態のために1.8ミリリットルの培地を細胞に加える。

コントロール化合物または試験化合物のいずれかで処理した細胞を、摂氏37度および5%二酸化炭素で加湿された環境で所望の時間インキュベートします。処理期間に続いて、200マイクロリットルの10X TMREを細胞に加えます。15%二酸化炭素加湿環境で摂氏37度で30〜5分間インキュベートします。

培地を穏やかに吸引し、バックグラウンド干渉を最小限に抑えるために細胞をPBSで2回すすぎます。次に、カバースリップを治療条件のラベルが付いた顕微鏡スライドに反転させます。画像 細胞は549ナノメートルの励起と575ナノメートルの発光で生きています。

共焦点顕微鏡を使用して、細胞の完全性が失われる前に、高速画像キャプチャで複数のZスタックフィールドをキャプチャします。後で分析するために、画像ファイルを保存して保存します。活性型ミトコンドリアを有する細胞はTMRE染色を保持し、高い蛍光を示した。

脱分極または不活性のミトコンドリアは、膜電位が低下し、TMREを保持できず、低い蛍光シグナルを示します。