融合タンパク質のアミノ末端で小胞核形成ペプチドまたはVNP配列タグをクローニングした後、5ミリリットルのリソジェニーブロスまたはLBスターターを、摂氏37度で飽和まで新鮮な細菌形質転換から培養します。次に、それを使用して、500ミリリットルの円錐形フラスコに適切な抗生物質の選択を含む25ミリリットルの素晴らしいブロスまたはTBを接種します。フラスコを摂氏37度のインキュベーター内でインキュベーター内で、毎分200回転または25ミリメートルの軌道スロー以上で振とうしながら、培養液が600ナノメートルの光学密度値(OD 600)の0.8〜1.0に達するまでインキュベートします。
次に、IPTGを最大20マイクログラム/ミリリットルまたは84マイクロモルの最終濃度に添加することにより、T7プロモーターから組換えタンパク質発現を誘導します。誘導に十分な時間を与えた後、3000 Gで摂氏4度で20分間遠心分離することにより、細胞をペレット化します。上清を滅菌および洗剤フリーの0.45ミクロンPESフィルターに通して、長期保存用の培地を含む小胞を滅菌します。
ベシクルをより小さな容量に濃縮するには、培地を含む滅菌ベシクルを滅菌および界面活性剤を含まない0.1ミクロンMCEフィルターに通します。次に、0.5〜1ミリリットルの滅菌リン酸緩衝生理食塩水(PBS)でメンブレンを穏やかに洗浄し、セルスクレーパーまたはプラスチックスプレッダーを使用してメンブレンから小胞を慎重に取り除きます。ピペットを使用してベシクル濃縮液を新しいマイクロ遠心チューブに移します。
精製された小胞は摂氏4度で保存することができます。小胞脂質膜を破壊し、タンパク質を放出するために適切なスケジュールを使用して、滅菌培地中のタンパク質含有小胞を超音波処理する。超音波処理された懸濁液を39, 000Gおよび4°Cで20分間遠心分離し、小胞破片を除去する。
VNp6-mNeongreen発現コンストラクトを含む大腸菌BL21DE3、IPTGで一晩誘導されるmNeongreen蛍光を示しました。蛍光は、遠心分離によって細菌細胞を除去した後も培養物中に可視のままであった。透明化した培地中の培養液中のVNp-mNeongreenの存在を、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動により確認した。
PBSに再懸濁した精製小胞も蛍光を示した。
