Visualizing Recombinant Protein-Filled Vesicles from E. coli by Fluorescence Microscopy

ベシクル膜を染色するには、蛍光脂質色素FM4-64を精製ベシクルに最終濃度2マイクロモルで添加し、イメージング前に10分間インキュベートします。大腸菌培養物からタンパク質充填小胞を単離した後、精製した小胞を、形成させた1mm未満の薄い円形の2%LBアガロースパッドにピペットで移し、きれいなスライドガラス上にセットします。液体が乾いたら、パッドの小胞の上に50ミリメートル×25ミリメートルのカバースリップを置きます。

カバースリップをスペーサーと粘着テープで所定の位置に保持します。次に、油浸対物レンズを使用してスライドを倒立顕微鏡に取り付け、サンプルを2〜3分間放置して落ち着き、温度を平衡化させます。単一フレーム イメージの場合は、3 つのイメージ平均化を使用して、ハードウェアに依存するランダムなバックグラウンド ノイズを減らします。

タイムラプスイメージングの場合は、個々のフレームの間に3〜5分かかります。広視野蛍光顕微鏡イメージングは、精製された羊膜緑色含有小胞を示した。親油性蛍光色素FM4-64は、ベシクル膜の存在を確認した。

アムニオングリーンに融合した内膜タンパク質CydBとVNp6-mCherry2を発現する生細菌細胞の構造化照明顕微鏡は、小胞産生と貨物挿入を示しました。