まず、重合したページゲルサンドイッチを準備します。クランプと紙テープの層を取り除き、コームをゆっくりと取り外します。蒸留水で井戸をよくすすいでください。
ゲルサンドイッチを縦型電気泳動装置に正しく入れます。上部と下部のリザーバーにTBEバッファーを充填します。50ワットで少なくとも30分間、ゲル電気泳動のプレランを実行して、プレートをウォームアップします。
その間、乾燥したサンプルを5マイクロリットルの変性ゲルローディングバッファーに再懸濁します。次に、TBEバッファーを充填した小さなシリンジを使用して、ゲルのウェルから尿素を洗い流します。次に、サンプルをきれいなウェルにロードし、ロードの臭いに注意してください。
ゲルを50ワットで2時間、またはブロモフェノールブルー染料がゲルの2/3になるまで泳動させます。電気泳動後、電源を切り、ガラスサンドイッチを慎重に取り外し、ガラス板を清掃します。ゲルをゲルイメージャーに入れて、FAM標識オリゴヌクレオチドバンドの蛍光を検出します。
1時間、4時間、15時間のインキュベーション後、5または50マイクロモルのBsep 1を、G4 TBA、一本鎖TBA、および二本鎖TBAの2つのマイクロモルサンプルと反応させました。サンプルセットごとにコントロールをロードしました。G4 TBA基質は、アルキル化とその後の鎖切断にG8のみが利用可能であったため、アルキル化付加物を1つだけ示しました。
すべてのグアニンがBsep反応に敏感であったため、一本鎖および二本鎖TBAでは、切断産物の複数の付加物およびバンドが観察されました。プロービング反応とトリスバッファーは、望ましくない求核剤の存在により非効率的なケミカルマッピングをもたらし、固有活性の低下を引き起こしました。G4 TBAサンプルは、撚り鎖切断を伴わない付加体の形成のみを示しました。
一本鎖および二本鎖のTBAでは、24時間のインキュベーションのみがDNA断片化を引き起こし、トリスなしの15時間の断片化に匹敵しました。
