ミツバチを2マイクロリットルの6xHisタグ付き組換えタバコエッチングウイルスまたはTEVプロテアーゼでインキュベートすることにより、クロマチン単一コピー遺伝子座の精製に使用した磁気ビーズからlexA CBPクロマチン環複合体を遊離させます。磁気ラックトランスファーを使用して最終溶出液からミツバチを分離した後、切断されたクロマチン環を含む溶出液を新しい1.5ミリリットルの反応チューブに入れます。ここでも、チューブを磁気ラックに置き、最終溶出液から残留ビーズを分離します。
ビーズを750マイクロリットルの冷炭酸アンモニウム緩衝液に再懸濁してから、DNAおよびタンパク質分析のためにいくつかのサンプルを摂氏20度で保存します。最終溶出液からサンプルを取り出し、DNAおよびタンパク質分析のために摂氏20度で保存します。さらに、残留ビーズからサンプルを採取します。
750マイクロリットルの冷炭酸アンモニウム緩衝液中で、摂氏4度で毎分20回転しながら、磁気ビーズを2回ずつ20分間洗浄して、変性溶出を開始します。次に、500マイクロリットルの0.5モルの水酸化アンモニウムをビーズに加え、結合したlexAクロマチン複合体を抽出し、室温で30分間インキュベートします。磁気ラックを使用して懸濁液からビーズを分離し、溶出液を低結合反応チューブに移します。
低結合反応チューブを室温で30分間インキュベートし、磁気ラックを使用して懸濁液からビーズを分離します。完了したら、溶出液を低結合反応チューブに移します。ビーズを750マイクロリットルの脱イオン水に再懸濁し、DNAおよびタンパク質分析用のサンプルを採取します。
最後に、最終溶出液からDNAおよびタンパク質分析サンプルを採取します。この研究では、ARS316遺伝子座と組換え株の精製効率を定量化し、対照遺伝子座PDC1と比較しました。ARS316遺伝子座は、PDC1と比較してフロースルーの回収率が低いことを示しました。
TEVプロテアーゼの切断が不完全であったため、クロマチン環の一部がTEVビーズに結合したままであったが、変性溶出により80〜90%のARS316遺伝子座の回収率が得られた。これは、定量された画分のいずれにもARS316遺伝子座の濃縮を示さなかった対照株と比較して、酵母ゲノムのサイズを考慮に入れた場合のTEVビーズおよび変性溶出画分中のARS316分子の高濃縮に相当します。TEV溶出後、TEV切断効率が100%ではなかったため、ビーズはARS316遺伝子座の回収率が高く、その結果、クロマチン環の一部がビーズに結合したままになりました。
しかし、変性エリュージョンは、酵母ゲノムのサイズを考慮に入れると、ARS316遺伝子座の80〜90%の回収率と、ARS316分子の高濃縮に対応する組換え株を示しました。
