3齢幼虫の脳の生細胞イメージングを行うには、解剖およびイメージング媒体を含む3ウェル解剖皿の最後のウェルで解剖された脳と単離された脂肪体を収集することから始めます。スライドの背面に気体透過膜を置き、スプリットリングを中央に押し込みます。200マイクロリットルのマイクロピペットを使用して、可能な限り最大の脂肪体と130〜140マイクロリットルの培地を備えた最大10個の解剖された脳を膜の中心に移します。
イメージングする神経幹細胞集団と顕微鏡の種類に応じて脳の向きを変え、サンプルが顕微鏡の対物レンズに近いことを確認します。たとえば、中枢脳葉の神経幹細胞を画像化するには、脳葉が目的に最も近いことを確認します。次に、ガラスカバーをそっと置き、メンブレン上の溶液の上に滑り、脳と脂肪体で溶液をメンブレン全体に広げます。
実験室の組織をカバースリップの端に保持して、脳が押しつぶされることなくカバースリップに触れるまで余分な溶液を吸い取ります。次に、絵筆を使って溶けたワセリンを縁に沿って塗ってカバースリップを固定し、ゼリーを固めます。400マイクロリットルのイメージング媒体をマルチウェルマイクロスライドのウェルに加えます。
以前に解剖した脂肪体をこの井戸に移します。次に、ウェルの中心近くのクラスターに最大10個の脳を配置します。画像化する神経幹細胞集団と顕微鏡の種類に応じて脳の向きを変えます。
脳を2〜5分間井戸に落ち着かせます。マイクロスライドをスライドカバーで覆ってから、顕微鏡に移してください。最小のレーザー出力と露光時間を使用して取得プロセスを開始し、光の漂白を最小限に抑えます。
UAS駆動のチェリージュピターと両性具有のタグ付きピンGFPを発現する幼虫の脳をマルチウェルイメージングスライドを使用し、脂肪体補充なしでイメージングしたところ、ピンは有糸分裂中に有糸分裂紡錘体が一貫して整列する神経芽細胞を分割する際に顕著な頂端三日月を形成したことが明らかになりました。これらのサンプルでは、細胞周期の長さはイメージング時間の増加とともに増加しました。膜結合スライド上の脂肪体補充培地で画像化されたサンプルは、細胞周期長の増加を示さなかった。
さらに、4つの分裂を有する神経芽細胞が10時間の膜結合スライド上に観察された。
