実験の前にすべての試薬を準備することから始め、基底膜マトリックスを氷上で解凍します。次にマウス単層培地を調製する。解凍した基底膜を冷たいネズミ単層培地で1〜20に希釈し、氷上に保ちます。
滅菌鉗子を使用して、0.4マイクロメートルの透明な細胞培養インサートを24ウェル組織培養プレートの単一ウェルに入れます。インサートのコーナープロングをつかみ、ウェルに移します。適切な数の細胞培養インサートが培養に使用可能になるまで繰り返します。
各細胞培養インサートの頂端表面を希釈した基底膜マトリックスで覆うには、P 200ピペットの先端をインサートの中央に置き、150マイクロリットルのマトリックスを排出します。次に、プレートを5%二酸化炭素を含む滅菌37度インキュベーターに移し、少なくとも1時間行います。インキュベーションの最後に、24ウェルプレートを45度の角度で回転させます。
プロングの角に1本の指を置き、インサートを安定させます。P 200ピペットチップをインサートの底面に沿ってそっと置き、地下室のマトリックスを取り外します。カルシウムまたはマグネシウムイオンを含まない150マイクロリットルの滅菌DPBSで各細胞培養インサートを洗浄して余分な残留物を取り除き、生物学的安全キャビネットで最低10分間乾燥させます。
インサートが乾燥したら、400マイクロリットルのマウス単層培地を底面に加え、75マイクロリットルを細胞培養インサートの上に追加します。すべての細胞培養インサートが浸るまで繰り返します。必要になるまで、プレートを生物学的安全キャビネットまたはインキュベーターに置いておきます。
次に、成熟腸コロノイドの24ウェルプレートをインキュベーターから取り出し、生物学的安全キャビネットの下に置きます。滅菌チップを使用して培地を吸引し、室温で1ミリリットルの滅菌DPBSで各ウェルを洗浄します。滅菌チップを使用して、カルシウムまたはマグネシウムイオンを含まないDPBSを除去します。
継代する各ウェルに500マイクロリットルの酵素解離試薬を加えて基底膜マトリックスの各プラグを消化します。プラグを壊すには、24ウェルプレートを45度の角度で回転させます。ピペットの先端をプラグの端に置き、各プラグを約6〜10回ピペッティングしてゆっくりと外します。
24ウェルプレートを5%二酸化炭素を含む37度の滅菌インキュベーターに3〜4分間戻します。インキュベーション後、生物学的安全キャビネットの下で各ウェルについてトリプシンを5〜7回上下にピペットで固定します。解離したコロノイドを各ウェルから滅菌済みの15ミリリットルのコニカルチューブに移し、氷冷マウス洗浄培地で最大10ミリリットルの容量にします。
次に、部分的に消化されたコロノイドを300 Gで、スイングバケット遠心分離機で摂氏4度で5分間遠心分離します。生物学的安全キャビネットの下で、10ミリリットルのピペットを使用してペレットから上清を取り除きます。また、P200ピペットを用いて残りの培地をすべて除去する。
次いで、75マイクロリットルのマウス単層培地を添加してコロノイドペレットを再懸濁する。75マイクロリットルのコロノイド懸濁液を各細胞培養インサートの中心に分注します。懸濁液をウェルに加える前に、懸濁液を1回または2回静かにピペットで移して、均一なメッキを確保します。
細胞培養インサート付きの24ウェルプレートを回転プラットフォームに10分間置き、細胞培養インサート全体に均一に分散させてから、プレートを5%二酸化炭素インキュベーター内の滅菌37°Cに入れます。インキュベーションの最後に、細胞培養物の内側にチップを並べて置き、P 200ピペットで培地を3〜5回ピペッティングすることにより、付着していないコロノイド断片を取り除きます。付着した腸細胞を破壊しないでください。
培地とコロノイドの混合物を直ちに除去する。すべての細胞培養インサートが洗浄されるまで繰り返します。次に、150マイクロリットルの予熱したマウス単層培地を各細胞培養インサートの頂端側に追加します。
400マイクロリットルの加温マウス単層培地を新しい24ウェルプレートの各ウェルに加える。滅菌鉗子を使用してプロングをつかんで、細胞培養インサートを新しいプレートに移します。目的のコンフルエンシーが得られるまで、1日おきに培地を交換してください。
細胞培養インサートにプレーティングされた酵素的に破壊されたコロノイドは、最初は15〜150細胞の範囲の細胞クラスターに現れました。3日目に、細胞は平らになり、細胞培養インサートをゆっくりと覆い、一般的にコンフルエントに達しました。次の数日間、単分子膜は成長し続け、定量的に測定できる連続的な障壁を形成しました。
