氷上の1.5ミリリットルのマイクロ遠心チューブで、10マイクロリットルの無細胞抽出物を4マイクログラムのプラスミドDNAおよび25マイクロリットルの2X無細胞タンパク質合成バッファーと混ぜ合わせます。二重蒸留水で最大50マイクロリットルの総容量を作り、無細胞タンパク質合成溶液を調製します。0.75グラムのアガロースを秤量し、それを100ミリリットルの二重蒸留水バッファーに加えて、0.75%アガロースを調製します。
0.75%アガロースを高出力で30秒間バーストでマイクロ波化し、溶融アガロース50マイクロリットルを1.5ミリリットルのマイクロ遠心チューブまたは所望の形状の型にピペットで入れます。溶融したアガロースを摂氏50度に設定されたヒートブロックに置き、アガロースを冷ましますが、重合させません。次いで、ピペットチップでピペッティングおよび攪拌することにより、溶融アガロースを無細胞タンパク質合成溶液と混合する。
ゲルを室温まで冷却し、約2分間重合させます。重合したアガロースをスパチュラで1.5ミリリットルのマイクロ遠心チューブに移し、液体窒素中で瞬間凍結します。瞬間凍結したヒドロゲルを摂氏マイナス80度の貯蔵庫に1時間入れます。
その後、マイクロ遠心チューブの蓋を外します。チューブをワックスフィルムで覆い、フィルムに穴を開けて水分を乾燥させます。凍結乾燥機の温度を摂氏マイナス20度、圧力を0.1ミリバールに設定し、無細胞タンパク質合成装置を18時間または一晩凍結乾燥します。
凍結乾燥装置を余分な液体なしで50マイクロリットルの二重蒸留水で30分間再水和し、スパチュラを使用してゲルを黒色の384ウェルマイクロタイタープレートに移します。最後に、マイクロタイタープレートをプレートリーダーに置き、画面に表示されるプレートリーダーの設定を使用して蛍光の検出と分析を行います。大腸菌細胞ライセートを用いたヒドロゲル中でのeGFPおよびmCherryの無細胞タンパク質合成をこの図に示します。
0.75%アガロースゲルをDNAテンプレートなしで、4マイクログラムのeGFPまたはmCherryテンプレート、または4マイクログラムのeGFPおよびmCherryテンプレートで調製しました。2つのチャネルのオーバーレイも示され、オーバーレイには微分干渉コントラスト画像が含まれます。その結果、アガロースにおけるmCherryとeGFPの両方の共発現が確認されました。
