開始する前に、滑膜線維芽細胞の単離を行い、この手順でコラーゲンコーティングディッシュから採取した非接着細胞を使用します。コラーゲンでコーティングされていない40〜60ミリメートルの皿に非接着細胞を播種します。バルク細胞を5%二酸化炭素を含む加湿雰囲気中で摂氏37度で1日培養します。
非付着性リンパ球を除去するには、培養培地を吸引してから、新しい培地を追加します。接着バルク細胞を、コンフルエントを維持しながら、2日ごとに培地を交換しながら1〜2週間培養します。その後、PBSまたはHBSSで2回洗浄します。
HBSS中の0.05%トリプシンで処理して滑膜マクロファージを選択し、5%二酸化炭素を含む加湿雰囲気中で摂氏37度で3分間インキュベートします。次に、HBSS中の0.05%トリプシンに培地を穏やかに加えます。このステップの後、培地を細胞に直接注がないでください。
剥離した細胞を除去するには、培養培地を吸引してから、新鮮な培地を穏やかに加えます。2〜3回繰り返し、使用するまで新鮮な培養培地で皿上の細胞を維持します。マクロファージ様細胞を7〜8週齢の雌C57BL/6マウスから単離し、RT-qPCRで解析した。
汎マクロファージマーカーCD68、EMR1、ITGAM、CSF1RのmRNA発現は、滑膜炎組織からのマクロファージリッチ単離を示した。マクロファージの純度を確立するために、マクロファージおよび他の細胞型の表面タンパク質マーカーをフローサイトメトリーによって分析した。細胞の90%以上がマクロファージマーカーCD45、CD11bおよびF4/80を発現したが、好中球マーカーLy6GおよびT細胞マーカーCD3の発現は1%未満であった
