まず、90〜120マイクロリットルのホルムアルデヒド架橋C.Elegansサンプルをポリスチレン超音波処理チューブに混合して分注します。2X界面活性剤を含む等量の再懸濁バッファーを追加します。水浴超音波処理装置で7分間超音波処理します。
ピペッティングでサンプルを静かに混合し、超音波処理をさらに7分間繰り返します。完了したら、超音波処理したライセートを1.5ミリリットルのチューブに移します。界面活性剤を含まない半容量の再懸濁バッファーを添加します。
摂氏4度で13, 000 Gで15分間遠心分離した後、ライセート上清を4つの部分に分けます。インプットライセート部分を摂氏マイナス20度で1.5ミリリットルのチューブに保管します。0.5マイクログラムの抗H3K9トリメチル化、抗ヒストンH3またはIgGを適切な免疫沈降またはIPサンプルに添加します。
反応液を摂氏4度で一晩回転しながらインキュベートします。翌日、IP サンプルあたり 9 マイクロリットルのプロテイン G コーティング磁気ビーズを 1.5 ミリリットルのチューブに分注します。1ミリリットルのFA-150で2回洗浄した後、磁気ビーズをFA-150バッファーに再懸濁します。
完了したら、7.5マイクロリットルの磁気ビーズ懸濁液を各IP抗体混合物に加え、チューブを摂氏4度で2時間回転させてインキュベートします。次に、各緩衝液を少なくとも200マイクロリットル使用して磁気ビーズを7回洗浄します。各洗浄液を摂氏4度で5分間回転しながらインキュベートした後、ビーズを磁気スタンドに集めて洗浄液を吸引します。
バッファーの最後の洗浄を吸引した後、磁気ビーズを 50 マイクロリットルのクロマチン IP 溶出バッファーに再懸濁し、1.5 mm リットルのチューブに移します。サーモミキサーでサンプルを溶出させた後、ビーズを磁気スタンドに集め、上清を新しいチューブに移します。さらに50マイクロリットルのクロマチン免疫沈降溶出バッファーで溶出を繰り返します。
完了したら、合計100マイクロリットルの上清を採取してから、逆架橋とDNA溶出に進みます。
