まず、湾曲した鉗子を使用して眼球摘出術用の安楽死マウスを配置し、眼球の周りの組織を押して眼球をソケットから移動させます。次に、眼球を持ち上げて取り外し、解剖トレイ内の新しいPBSに移します。超極細ハサミで視神経をできるだけ眼球に近づけて切り、眼球後部の視神経出口から先端の細いピンセットを慎重に眼球に挿入します。
次に、目の後部にハサミを挿入し、後部から角膜強膜接合部に向かって切開を開始し、接合部の半分が分離するまで切開を続けます。角膜をそっと押して、水晶体が切開部から出るようにします。先端の細いストレートピンセットを使用して、レンズから大きな組織片を慎重に取り除きます。
赤道域を見つけたら、水晶体を浅く突き刺し、水晶体嚢を取り出します。レンズファイバーセルを1%パラホルムアルデヒドを含む60mmディッシュに移します。鋭利なメスを使用して、繊維細胞のボールをその前後軸に沿って半分に分割します。
次に、同じ軸に沿ってさらに半分をカットして、クォーターを作成します。まっすぐなピンセットを使用して、水晶体ファイバーセルクォーターから核領域を取り除きます。次に、200マイクロリットルの1%パラホルムアルデヒドを48ウェルプレートに加えます。
水晶体皮質をプレートに移し、室温で15分間インキュベートし、300RPMで穏やかに振とうします。ブロッキング後、適切な一次抗体を 48 ウェルプレートに添加し、サンプルを一次抗体溶液に移します。サンプルを摂氏4度で一晩インキュベートし、穏やかに振とうまたは変異させます。
翌日、サンプルをPTXで洗浄し、同様に二次抗体とインキュベートします。サンプルを洗浄した後、1滴または50マイクロリットルの封入剤をプラス充電顕微鏡スライドに加えます。ティッシュを封入剤に入れます。
そして、ピンセットを使用して、繊維細胞を互いに静かに分離します。次に、分離したセルと封入剤の上にカバースリップをそっと置きます。余分な培地を取り除いた後、共焦点顕微鏡検査の前に、マニキュアを使用してスライド上のカバースリップの端を密封します。
水晶体の解剖と水晶体嚢の除去後、繊維細胞の塊を濡れた手袋をはめた指先に移し、すべての方向に静かに転がして水晶体核を分離します。次に、水晶体核を48ウェルプレートで新たに作製した1%パラホルムアルデヒド溶液に移し、穏やかに振とうまたは変異させながら摂氏4度で一晩インキュベートします。翌日、サンプルを1%パラホルムアルデヒドを含む60ミリメートルの皿に移し、鋭利なメスを使用して水晶体核を前後軸に沿って半分に分割し、次に4分の1に分割します。
次に、前に実証したように、サンプルを後付けし、ブロックし、染色し、マウントします これらの調製物において、異なるレンズ領域から、固有の形態を有するレンズファイバ細胞の束が見出される。F-アクチンネットワークの染色は、分化および成熟した線維の細胞膜での濃縮を示し、F-アクチンシグナルは核線維の細胞質に存在します。走査型電子顕微鏡や分化線維細胞の共焦点画像では、ボールとソケットのインターディゲーションに小さなインターロッキング突起が見られますが、成熟したファイバーには小さな突起で装飾されたパドルがあります。
核水晶体線維細胞の走査型電子顕微鏡および共焦点顕微鏡画像は、細胞膜が粗く、これらの細胞に水晶体の中心から舌と溝の挿入がある細胞の短辺にまれで大きなインターロッキング突起を明らかにします。
