Collection of Germinal Vesicle Oocytes from the Ovaries of CD-1 Mice and Induction of DNA Double-Strand Breaks

まず、プラスチック組織培養皿にM2 IBMX培地を滴下し、卵母細胞を単離する前に、皿を摂氏37度のホットブロックに少なくとも30分間置きます。安楽死させたマウスの卵巣を解剖し、M2 IBMXを入れた5ミリリットルの丸底チューブに入れます。卵巣を1.5ミリリットルのM2 IBMXが入ったプラスチック製の蓋に移します。

卵巣周囲脂肪組織または卵管セグメントを取り除き、27ゲージの針で卵巣を機械的に穿孔することにより、卵母細胞複合体を放出します。卵丘卵母細胞複合体をM2 IBMXの滴と共に培養皿に移す。そして、狭口径ガラス製牧草ピペットを用いたピペッティングを繰り返して卵丘細胞を除去した。

囲まれた核胚小胞またはGV期の卵母細胞を選択し、光から保護された摂氏37度のホットブロック上のM2 IBMX培地のドロップに移します。エトポシドを使用して二本鎖切断を誘導した後、GV期の卵母細胞を遺伝毒性物質の滴に暗所のホットブロック上に1時間置きます。400マイクロモルのIBMXを添加したM16培養液を卵母細胞に滴下し、長期間逮捕したままにします。

卵母細胞を摂氏37度、5%二酸化炭素のインキュベーターに入れます。