コントロールおよびエトポシド処理した胚小胞(GV)卵母細胞を、PFA-Tx 100バッファーを含む異なるプラスチック組織培養皿に室温で40分間置きます。卵母細胞を室温で3つの異なる50マイクロリットルの洗浄バッファーでリンスし、ホットブロック上の25マイクロリットルのブロッキングバッファーに1時間置きます。次に、γH2AXを認識する一次抗体を調製する。
一次抗体をブロッキングバッファーで1対200の比率で希釈し、卵母細胞を摂氏4度で15マイクロリットルの滴に一晩浸します。3つの異なる50マイクロリットルの洗浄バッファーで卵母細胞を洗浄します。Alexa Fluor 488結合成長抗ウサギ二次抗体を調製します。
ブロッキングバッファーで希釈した後、卵母細胞を15マイクロリットルの抗体滴に、光から保護された摂氏37度のホットブロックに1時間浸します。遠赤色蛍光DNA色素DRAQ7を取り、卵母細胞を室温で暗所で10分間移してから、3つの異なる洗浄バッファーで洗浄します。共焦点顕微鏡用の35mmガラス底ペトリ皿の卵母細胞に少量の洗浄バッファーを加えます。
レーザーコントローラーと共焦点システムのレーザーの電源を入れます。顕微鏡コントローラーとランプの電源を入れた後、共焦点ソフトウェアを開き、40倍オイルレンズを選択します。卵母細胞の入った皿を標本ホルダーに入れ、ジョイスティックを使用してステージをX、Y、Z軸に動かして卵母細胞に焦点を合わせます。
レーザー出力、ゲイン、ピンホールのサイズを実験ごとに個別に設定して、飽和を最小限に抑えます。卵母細胞ごとに、DNA領域の核に特に関心のある領域を設定します。DNA領域の境界を定義し、Zステップサイズを3マイクロメートルに調整します。
次に、スキャンを開始します。選択したフォルダー内の各セルの画像を保存します。ImageJソフトウェアを開き、画像をクリックしてから、色をクリックし、チャンネルを分割します。
すべてのチャネルを分割します。ルックアップテーブルをクリックして、各チャンネルの好みの色を選択します 画像、色、マージチャンネルをクリックして、ガンマH2AXとDNAのチャンネルをマージします。高レベルのDNA損傷がある周囲の核小体卵母細胞で、画像、スタック、Zプロジェクトをクリックし、フリーハンド選択コマンドを使用して、DNA領域全体を選択します。
分析をクリックし、次に測定をクリックしてガンマH2AX蛍光を測定し、測定値をExcelファイルにコピーします。エトポシド処理後0時間後の包核小体GV期の卵母細胞におけるγH2AX蛍光をこの図に示す。ガンマH2AXは、すべてのエトポシド濃度で曝露直後に増加し、その増加は濃度に依存します。.
エトポシド処理後20時間の囲まれた核小体GV期の卵母細胞におけるγH2AX蛍光をここに示します。ガンマH2AXは、すべてのエトポシド濃度で曝露後20時間減少します。長期前期停止後、GV期卵母細胞はガンマH2AX病巣数および強度を減少させる能力を示し、GV期停止卵母細胞における活発な修復過程の存在を示唆した。
