まず、目の保護具、サージカルマスク、非ラテックス手袋などの個人用保護具を着用してください。20ミリリットルのマウス神経芽腫またはBHK-21細胞を、EGM中の1ミリリットルあたり5番目の細胞の10倍の3.0倍の濃度に調製します。準備した細胞は、使用する準備ができるまで冷たく保ちます。
次に、CVS-11ウイルスをEGMで希釈して調製します。準備したウイルスは、使用するまで冷たく保ってください。湿度スライドチャンバーとポリテトラフルオロエチレンでコーティングされた顕微鏡スライドを70%エタノールで洗浄し、バイオセーフティキャビネットで風乾させます。
洗浄後、スライドチャンバー内の吸収紙のストリップに蒸留水を加えて、手順全体を通して一定の湿度を確保します。鉛筆を使用して、各スライドにロット番号、日付、セルタイプなどの必要な識別情報をラベル付けします。ラベルの付いたスライドをスライドチャンバーに入れて保管します。
次に、50マイクロリットルのウイルス希釈液を、繰り返しピペットを使用して顕微鏡スライド上のウェルに塗布します。50マイクロリットルの細胞希釈液を各ウェルに塗布し、すでにウェル内にあるウイルスでピペットチップを汚染しないように注意してください。その後、湿度スライドチャンバーを閉じ、摂氏34度から36度の湿度の高いインキュベーターに入れます。
次に、スライドを湿度チャンバーから取り出し、上澄み液を細心の注意を払って吸引します。PBSで満たされたcoplin瓶でスライドを2分間洗浄し、風乾させます。スライドを冷たいアセトンで満たされた銅瓶に入れて、サンプルを固定します。
可燃性物質が承認されている摂氏マイナス20度の冷凍庫に瓶を少なくとも1時間入れます。アセトンが蒸発し、スライドが乾燥したら、狂犬病直接蛍光抗体複合体をスライドのウェルに適用し、摂氏34〜36度の湿度の高いインキュベーターでスライドを30分間インキュベートします。次に、スライドをPBSのコプリンジャーで2回ずつ2分間洗浄します。
スライドを風乾し、0.05モルのトリス、0.15モルの塩化ナトリウムを20%グリセロール封入剤でカバースリップに取り付けます。200倍の倍率の蛍光顕微鏡を使用して、細胞の感染力を評価します。次に、残りのスライドをインキュベーターと湿度チャンバーから取り外します。
各ウェルから上澄み液を注意深く吸引します。次に、スライドをPBSの入ったコプリンジャーに1〜2分間入れます。スライドを約30分間自然乾燥させ、使用するまで摂氏マイナス80度で保管してください。
