まず、ロバ血清を含むすぐに使用できるブロッキング溶液を1滴、組織サンプルにピペッティングします。その後、サンプルを室温で30分間インキュベートします。硬い表面の端を叩いて、スライドから余分なブロッキング溶液を取り除きます。
一次抗体を抗体希釈バッファーで希釈し、各サンプルについて100マイクロリットルの最終溶液を調製します。一次抗体ごとに1本、アイソコントロール抗体ごとに1本のチューブをセットします。1つのサンプルに100マイクロリットルのアイソコントロール抗体を均等に広げ、100マイクロリットルのミエロペルオキシダーゼとシトルリン化ヒストンH3、またはミエロペルオキシダーゼと好中球エラスターゼ抗体希釈液をもう1つのサンプルに均等に広げます。
スライドを湿式チャンバーに入れ、摂氏4度で一晩保管します。翌日、スライドから余分な一次抗体溶液をたたき取り、キュベットに積み重ねます。残りの一次抗体溶液を除去するために、トゥイーンを含むトリス緩衝生理食塩水を使用して、スライドをそれぞれ5分間、3回すすぎます。
ミエロペルオキシダーゼ用のロバ抗ヤギ抗体とシトルリン化ヒストンH3染色用のロバ抗ウサギの2つのはっきりとした蛍光性二次抗体を調製します。各抗体を抗体希釈バッファー中で7.5マイクログラム/ミリリットルの濃度に希釈します。スライドをウェットチャンバーに入れ、100マイクロリットルの二次抗体溶液を各サンプルに分注します。
光から保護した室温で30分間インキュベートします。スライドをタップして余分な二次抗体溶液を取り除きます。スライドをスライドラックに入れます。
PBSで満たされた染色ジャーにスライドを5分間ずつ3回浸し、未結合の抗体を洗い流します。dappy溶液を準備し、脱イオン水で1ミリリットルあたり1マイクログラムの濃度に希釈します。スライドラックをダッピー溶液の入った染色ジャーに浸し、暗所で室温で5分間インキュベートします。
次に、スライドラックをPBSの入った染色ジャーに5分間浸し、余分なダッピー溶液を洗い流します。最後に、カバーガラスと封入剤を使用してサンプルを封入します。シトルリン化ヒストンH3抗体は細胞外ヒストンにのみ結合し、細胞内ヒストンの染色は見られませんでした。
ヒトまたはマウスの特異的ミエロペルオキシダーゼ抗体は特異的な染色を示さなかった。一方、普遍的なヒトおよびマウスの抗体は、ミエロペルオキシダーゼに対して一貫した良好な染色を示しました。ブロッキング剤を使用しない場合、一部のマウスサンプルでは、より非特異的および部分的な陽性染色が示されました。
ブロックすると、5 分間のブロック時間が 10 分のブロック時間と比較して良好な結果を示しました。電子レンジとウォーターバスの高温は、一貫して中程度から良好な抗原賦活化を示しました。一方、摂氏60度の水浴では、部分的にしか陽性または染色がありませんでした。
二重染色では、摂氏96度のウォーターバスでインキュベートしたサンプルについて、より良好な結果が得られました。しかし、インキュベーション時間である96°Cで40分を超えると、抗体染色の強度が低下しました。
