まず、FBSを110, 000 G、摂氏4度の超遠心分離機で一晩遠心分離し、内因性sEVを除去します。上清を0.2ミクロンの限外ろ過膜でろ過して滅菌し、sEVフリーのFBSを生成します。次に150ミリ培養皿に、20ミリリットルのDMEM培地に10〜7番目の不死化骨髄由来マクロファージを約3回プレートする。
マクロファージからsEVを回収する前に、5%二酸化炭素下で摂氏37度で一晩インキュベートします。翌日、培地を廃棄した後、リン酸緩衝生理食塩水またはPBSで細胞を洗浄します。培地を10%sEVを含まない遊離ウシ胎児血清を含むDMEMと交換してから、細胞を摂氏37度および5%二酸化炭素でインキュベートします。
実験の要件に基づいて、細胞の上清を収集し、50ミリリットルの遠沈管に移します。チューブを300 Gで10分間遠心分離して細胞を除去します。結果の上清を各チューブから新しい50ミリリットルの遠心分離チューブに移し、ペレットを廃棄します。
このとき、上清を2000Gで10分間遠心分離し、死菌を除去した。次に、上清を新しい高速遠心チューブに移し、ペレットを廃棄します。次に破片や微小胞を除去し、得られた上清を高速遠心分離機を用いて10, 000 Gで30分間遠心分離します。
得られた上清を新しい超遠心チューブに移し、各チューブに35ミリリットルを加え、ペレットを廃棄します。上清を廃棄する前に、スイングバケットローター遠心分離機で超遠心チューブを110, 000 Gで70分間遠心分離します。得られた粗sEV濃縮ペレットを1ミリリットルのPBSで洗浄します。
再び、1つのチューブで洗浄したペレットに1ミリリットルのPBSを加え、連続的にピペッティングして混合します。得られた1ミリリットルのPBS懸濁液をペレットを含む別のチューブに移し、チューブ内のすべてのペレットがピペッティングによって混合されるまで同じことを繰り返します。得られた1ミリリットルのsEVリッチPBSを新しい超遠心チューブに移します。
次に、新しいチューブを卓上型超遠心機で 110 、 000 G で 70 分間遠心分離します。上清を捨てた後、得られた粗sEVs濃縮ペレットを100マイクロリットルのPBSで洗浄する。標準的なプロテインチューブに1.2ミリリットルのタンパク質調製溶液を加えて、その中に存在する30ミリグラムのBSAを溶解します。
得られたタンパク質標準溶液をPBSで希釈して、その濃度を25ミリグラム/ミリリットルから0.5ミリグラムに下げます。8つの異なる容量の希釈タンパク質標準溶液を96ウェルプレートのウェルに加え、PBBを使用して各ウェルの容量を20マイクロリットルにします。18マイクロリットルのHEPES溶解バッファーをサンプルウェルに追加し、続いて2マイクロリットルのsEVサンプルを追加します。
次に、製造元の指示に従って調製した200マイクロリットルのBCA作業溶液を各ウェルに追加します。プレートを室温で20〜30分間休ませます。最後に、マイクロプレートリーダーを使用して562ナノメートルの吸光度を測定します。
得られた結果を使用して、sEVの総タンパク質含有量を計算します。単離されたsEVの透過型電子顕微鏡画像は、典型的なカップ状の形態を示した。ナノ粒子追跡分析は、単離されたsEVがほとんど136ナノメートルに集中していることを示しました。
ウェスタンブロットは、単離されたsEVがCD9、ベータアクチン、およびTSG101を含むsEVマーカーを有意に濃縮していることを示しました。小胞体網状マーカーGRP94は、全細胞ライセートでのみ検出されました。その結果、高純度のsEVが得られることが示された。
