はじめに、単離した小さな細胞外小胞またはSEVを、110, 000 Gおよび4°Cの超遠心分離によって70分間2回洗浄します。小胞を500マイクロリットルのリン酸緩衝生理食塩水またはPBSに再懸濁します。次に、5マイクロリットルの100Xプロテアーゼ阻害剤をそれに加えます。
サンプルを40ワットで10分間超音波破砕し、3秒の超音波時間と5秒の間隔時間で行います。粉砕した混合物を13, 700 Gで4°Cで15分間遠心分離します。得られた上清に、ジチオスレイトールを終濃度50ミリモルとなるように添加する。
そしてそれを摂氏56度の水浴中で30分間インキュベートする。次に、50マイクロリットルの1モルヨードアセトアミドを上清に加えます。そして、暗所で室温で20分間反応させます。
混合物を13, 700 Gおよび4°Cで15分間遠心分離する。粗ペプチド抽出液を含む上清を10キロダルトンの超遠沈管に移した。限外ろ過チューブを13, 700 Gおよび摂氏4度で1時間遠心分離することにより、粗ペプチドからタンパク質を除去します。
収集した廃液を真空遠心濃縮機で摂氏45度で乾燥させます。脱塩には、すべての試薬の溶媒として質量分析グレードの純水を使用してください。まず、乾燥ペプチドを100マイクロリットルの0.1%トリフルオロ酢酸またはTFAに溶解し、脇に置いておきます。
次に、100マイクロリットルの純粋なアセトニトリルを各脱塩カラムに加えます。カラムを400 Gで室温で3分間遠心分離し、流出液を廃棄します。次に、脱塩カラムごとに100マイクロリットルの50%アセトニトリルを追加し、排水を廃棄する前に前述のように遠心分離を繰り返します。
次に、前述のように遠心分離する前に、各脱塩カラムに100マイクロリットルの0.1%TFAを追加します。もう一度、排水を捨てます。次に、脱塩ペプチドを脱塩カラムにピペットで入れます。
前述のようにカラムを遠心分離し、サンプルをロードします。回収した廃液を脱塩カラムに戻し、ローディングを繰り返します。次に、100マイクロリットルの0.1%TFAを追加します。
前述のように遠心分離し、廃液を廃棄する。最後に、0.1%TFAを含む50マイクロリットルの50%アセトニトリルを脱塩カラムのペプチドに加えます。遠心分離後、前述のように、新しい質量分析グレードの遠沈管に流出物を集める。
