単球単離と単球由来樹状細胞への単球分化

末梢血単核細胞の単離を開始するには、ヒトバフィーコートにアクセスし、7ミリリットルを滅菌した15ミリリットルの円錐管に移します。予備洗浄のために6ミリリットルのPBS溶液を加えます。スイングローターを備えた遠心分離機でチューブを1、100Gで10分間遠心分離し、室温でブレーキをかけます。

牧草地ピペットを使用して白血球懸濁液を回収し、新しい滅菌15ミリリットルのコニカルチューブに移します。白血球懸濁液にPBS溶液を10ミリリットルに達するまで添加し、ピペッティングで上下させて穏やかに混合します。次に、3ミリリットルの密度グラジエント培地を新しい滅菌15ミリリットルのコニカルチューブに入れて、密度グラジエント溶液を調製します。

室温になるまで待ちます。密度勾配培地を含む円錐管壁に5ミリリットルの希釈白血球懸濁液をゆっくりと加え、5〜3密度の勾配分離を作成します。媒体の邪魔をしないでください。

密度勾配培地中に存在する懸濁液を、スイングローター付きの遠心分離機で遠心分離し、ブレーキをオフにして、グラジエント分離に進みます。次に、Pastureピペットを使用して、PBMCの薄層25ミリリットルまでをPBSで満たされた新しい50ミリリットルのコニカルチューブに慎重に移し、よく混合して残留細胞と破片を除去し、サンプルを室温で600Gで10分間遠心分離します。上清を廃棄し、PBSを使用してサンプルを10ミリリットルまで充填します。

アリコートを取り、細胞を数えます。血小板を除去するには、通常のブレーキで遠心分離し、チューブを慎重に反転させて上清を捨てます。磁気活性化セルソーティングを用いた単球CD14陽性単離では、細胞ペレットをマイクロビーズバッファーおよびCD14免疫磁気ビーズに再懸濁します。

細胞懸濁液を摂氏4度で15分間インキュベートします。結合していないビーズを除去するには、10倍あたり1〜2ミリリットルのマイクロビーズバッファーを7番目の細胞に加え、懸濁液を室温で600Gで10分間遠心分離し、チューブを慎重に反転させて上清を廃棄します。LSカラムを準備し、マグネットの上に置いてから使用してください。

3ミリリットルのマイクロビーズ緩衝液ですすぎ、直ちに細胞ペレットを500マイクロリットルのマイクロビーズ緩衝液に10倍から8番目の細胞に再懸濁します。細胞懸濁液をLSカラムインレットに添加し、カラムアウトレットの下にある15 mmリットルのコニカルチューブに陰性細胞分画を回収します。3 ミリリットルのマイクロビーズバッファーでカラムを 3 回洗浄します。

最終洗浄後、カラムを磁石から取り外し、滅菌済みの 15 ミリリットルのコニカルチューブに置きます。5 ミリリットルのマイクロビーズバッファーをカラムインレットにピペットで移します。目的細胞を充填したシリンジプランジャーを直ちにカラムインレットに挿入し、カラム内の細胞を分注します。

次に、CD14陰性細胞分画とCD14陽性細胞分画を遠心分離し、上清を廃棄します。ヒト単球由来樹状細胞への単球分化のためには、CD14陽性細胞に適切な量の分化培地を添加することにより、1ミリリットルあたり1.3倍の10〜6番目の細胞を含む細胞懸濁液を調製します。Pastureピペットでピペッティングして単球を再懸濁します。

24ウェルプレートの1.3倍10個あたり1ミリリットル懸濁液/ウェルの6個目の細胞にプレーティングした後、5%二酸化炭素を含む37°Cの培養インキュベーターでインキュベートします。培地を交換し、2〜3日ごとに新鮮なサイトカインを補給します。分化した細胞を回収するには、マイクロピペットを使用して細胞懸濁液全体を滅菌コニカルチューブに移し、培養フラスコをPBSで2回洗浄します。

コニカルチューブを室温で180 Gで10分間遠心分離した後、ペレットを実験セットアップに適した培地または緩衝液に再懸濁します。単球分化の間、インターロイキン4および顆粒球マクロファージコロニー刺激因子刺激因子は細胞表現型を変化させた。データは、ヒト単球由来樹状細胞が、主に単球によって発現される表面マーカーCD14の発現を失い、CD1Aの有意な発現を獲得したことを示しました。

ヒト樹状細胞によって発現されるマーカー。また、ヒト単球由来樹状細胞は、ヒト樹状細胞および他の抗原提示細胞によって発現される抗原提示分子であるMHC2 HLA-DRのより高い発現を得る。