共焦点顕微鏡と40倍対物レンズを使用して、使用する脂質マーカーに適した蛍光チャンネルでスキャンプロファイルを作成します。取得モードとチャンネルを設定したら、ソフトウェアオートフォーカスをクリックしてフォーカス戦略を最適化します。次に、Zスタックの範囲を20ミクロンに設定します。
この後、タイルを最適化し、ビューアを開いてタイルの位置を選択します。次に、バッチ画像処理方式を用いて、拡張焦点深度方式で各Zスタックの最大投影を作成します。画像をエクスポートする前に、圧縮を「なし」に設定し、元のデータがチェックされていることを確認します。
得られた画像は、脂質マーカーを発現する蛍光チャネルのみの最大投影グレースケールTIFFです。Nile Red、BODIPY、または APOE を表す TIFF 画像を識別し、使用する方法に応じて、Nile Red、BODIPY、または APOE という名前のディレクトリ内の Images フォルダーに移動します。脂質ユニットソフトウェアを開きます。
「予測」タブで、省略記号をクリックし、名前付きのディレクトリに移動して、関連するディレクトリを選択します。脂質ユニットが画像を正しく識別したことを確認するには、クラスエントリを確認します。[予測] をクリックしてタスクの進行状況を観察し、[マスク分析] ツールを使用して、生成されたマスクを反復処理し、マスク イメージから閾値の脂質沈着量の定量的な数を提供します。
RPEの分化と成熟に成功すると、色素沈着と多角形の形態を持つコンフルエントな単層が示されました。対照的に、分化に失敗した場合、死にかけている細胞のクラスターが見られました。蛍光画像では、ナイルレッドとBODIPYの堆積物が小さくて明るい円形の点として現れました。
ネガティブな結果は、染色が弱いか、バックグラウンド強度が高いために、バックグラウンド蛍光を沈着物と間違えて、画像のセグメンテーションが正しくないことを示しています。APOE沈着物はサイズ、形状、シグナル強度が異なり、ばらつきを最小限に抑えるために染色法とイメージング法の最適化が必要であることが示されています。
