まず、犠牲にした10週齢のC57ブラック6J雄マウスに70%エタノールを十分にスプレーします。鉗子を使用して、後肢から皮膚を取り除き、大腿骨、脛骨、腓骨を取り巻くすべての四肢の筋肉を解剖します。採取した四肢の筋肉を、1ミリリットルの筋肉分離バッファーが入った2ミリリットルのチューブに入れます。
そして、ハサミを使って、収穫した筋肉をみじん切りにします。みじん切りにした筋肉懸濁液を、18ミリリットルの筋肉分離バッファーを含む50ミリリットルのチューブに移します。チューブをしっかりと閉じ、実験用フィルムで密封し、振とう水浴に水平に置きます。
30分後、5ミリグラムのI型コラゲナーゼを添加し、チューブをさらに30分間維持します。筋懸濁液を上下に10回ピペッティングした後、遠心分離機に上清を廃棄し、チューブ内に5ミリリットルの培地を残します。懸濁液を連続したセルストレーナーにピペットで移し、フロースルーを50ミリリットルのチューブに集めます。
懸濁液を遠心分離し、チューブ内に100〜200マイクロリットルしか残らなくなるまで上清を廃棄します。ペレットを2ミリリットルの赤血球溶解バッファーに再懸濁し、氷上で3分間インキュベートします。再度遠心分離し、20〜200マイクロリットルのピペットを使用してチューブから上清を取り除きます。
ペレットを100マイクロリットルの冷たいFACS緩衝液に再懸濁し、チューブを氷上に置いた。ネガティブコントロールのために10マイクロリットルの細胞懸濁液を除去した後、残りの90マイクロリットルを遠心分離し、上清を捨ててから、無血清DMEMで希釈した400マイクロリットルの固定生存率染色剤で細胞を室温で15分間インキュベートします。遠心分離後、100マイクロリットルのFACS緩衝液を加え、チューブを静かに3回反転させます。
再度遠心分離し、100マイクロリットルの一次抗体混合物をチューブに加えます。暗所で30分間インキュベートした後、遠心分離機にかけ、上清を廃棄します。次に、500マイクロリットルのPBSを加えて細胞を洗浄します。
再度遠心分離し、上清を除去してから、ペレットを500マイクロリットルのFACS緩衝液に再懸濁します。懸濁液を5ミリリットルのチューブに移します。細胞懸濁液を短時間ボルテックスしてから、フローサイトメーターで処理します。
選択した細胞を、FACS緩衝液を含む5ミリリットルのコーティングチューブに集めます。サイズと粒度に基づいて同定された単核細胞の75%は、固定可能な生存率染色マーカーが陰性であり、生細胞の平均34.3%でした。単一生細胞の約3%が、単球、内皮、白血球、および赤血球特異的マーカーに対して陰性であった。
次に、これらの陰性細胞をCD34およびITGA7マーカーの発現に従って選択しました。CXCR4の最終ゲーティングを行い、推定サテライトセルを選定した。また、CD34陽性ITGA7陽性細胞では、80%がCXCR4陽性であることが判明しました。
