FACSで単離したサテライトセルを遠心分離し、上清を廃棄します。細胞を1ミリリットルのPBSで洗浄し、遠心分離し、氷上で1ミリリットルの冷たい核抽出バッファーで20分間インキュベートします。20マイクロリットルのコンカナバリンAコーティング磁気ビーズを、850マイクロリットルの低温結合緩衝液を含む1.5ミリリットルのチューブに加えます。
次に、磁気ラックを使用して、1ミリリットルのコールドバインディングバッファーでビーズを2回洗浄し、ビーズをラックのチューブの側面に5分間蓄積させてから、300マイクロリットルのコールドバインディングバッファーに静かに再懸濁します。次に、核を遠心分離し、600マイクロリットルの核抽出バッファーに穏やかに再懸濁します。次に、600マイクロリットルの抽出核と300マイクロリットルのコンカナバリンAビーズスラリーを混合し、摂氏4度で10分間インキュベートします。
磁気ラックを使用して上清を除去した後、ビーズ結合核を1ミリリットルのコールドブロッキングバッファーで再懸濁します。再度、上清を除去し、ビーズ結合核を1ミリリットルのコールドウォッシュバッファーで2回洗浄します。上清を分離し、核ビーズ複合体を特異的一次抗体で静かに再懸濁し、穏やかに撹拌しながら摂氏4度で一晩インキュベートします。
翌日、上清を除去し、ビーズ結合核を洗浄してから、100マイクロリットルのコールドウォッシュバッファーに再懸濁します。100マイクロリットルの希釈プロテインA-ミクロコッカスヌクレアーゼをビーズ結合核100マイクロリットルに加え、摂氏4度で1時間撹拌しながらインキュベートします。インキュベーション後、上清を除去し、ビーズ結合核を2回洗浄してから、150マイクロリットルのコールドウォッシュバッファーに再懸濁します。
次に、100ミリモルの塩化カルシウムを3マイクロリットル加え、フリックしてすばやく混合し、氷上で30分間インキュベートします。150マイクロリットルの停止バッファーを添加して反応を停止し、摂氏37度で20分間インキュベートします。サンプルを遠心分離し、上清を新しい微量遠心チューブに移し、ペレットとビーズを廃棄します。
次に、10%ドデシル硫酸ナトリウム3マイクロリットルと2.5マイクロリットル/ミリリットルのプロテイナーゼK.Mixを反転して加え、摂氏70度で10分間インキュベートします。次に、300マイクロリットルのフェノール:クロロホルム:イソアミルアルコールとボルテックスを加えてから、2ミリリットルのフェーズロックチューブに移します。遠心分離し、同じチューブに300マイクロリットルのクロロホルムを加えます。
再度遠心分離し、上清を1.5ミリリットルのチューブに回収します。次に、1マイクロリットルのグリコーゲンを加え、次に750マイクロリットルの100%エタノールを加え、摂氏マイナス20度で一晩DNAを沈殿させます。翌日、遠心分離によりDNAをペレット化し、1ミリリットルの100%エタノールでペレットを洗浄し、2回遠心分離してからピペットで残留エタノールを除去します。
ペレットを5分間風乾し、25マイクロリットルのtris-EDTA緩衝液に再懸濁します。H3KME2とH3K27ACは、PAC7、ITGA7、LAM2、CXCR4、VCAM1のTSSを中心に濃縮されました。しかし、ITGAM、PTPRC、PECAM、CKM、またはMHY3のH3K4ME2とH3K27ACは濃縮されていませんでした。
IgGサンプルではほとんどシグナルが得られませんでした。HOMERの既知のモチーフ解析、ARピークおよびサテライト細胞、および標的領域の割合が示されています。Seekerの分析では、ピークスコアが50を超えるピークが約500個あり、そのうちスコアが100を超えるピークが200個以上ありました。
