Generating Submitochondrial Vesicles from Saccharomyces cerevisiae Mitochondria to Isolate Mitochondrial Contact Sites

まず、新たに単離した粗酵母ミトコンドリア10ミリグラムを採取し、ピペッティングにより1.6ミリリットルのSMバッファーに摂氏4度で再懸濁します。次に、ミトコンドリア懸濁液を予冷した100ミリリットルの三角フラスコに移します。20ミリリットルのガラスピペットを使用して、氷の上で絶えず穏やかに攪拌しながら、16ミリリットルの膨潤緩衝液をゆっくりと加えます。

氷上で30分間、一定の穏やかな攪拌下でサンプルをインキュベートします。次に、5ミリリットルのガラスピペットを使用して、5ミリリットルの2.5モルのスクロース溶液をゆっくりと加え、内膜を収縮させます。氷上で15分間、穏やかに攪拌しながらサンプルをインキュベートします。

サブミトコンドリア膜小胞を生成するには、ミトコンドリア懸濁液を予冷ロゼットセルに移し、氷浴でロゼットセルを冷却しながら、懸濁液を10%振幅で30秒間超音波処理します。懸濁液を氷浴で30秒間休ませます。