まず、調製した酵母サブミトコンドリア小胞を採取し、生成された小胞と残りの無傷のミトコンドリアを20, 000 Gで4°Cで20分間遠心分離します。無傷のミトコンドリアがペレットを形成し、小胞は上清にとどまります。次に、上清を真新しい超遠心分離チューブに移します。
カニューレを備えた1ミリリットルのシリンジを使用して、チューブの底に0.3ミリリットルの2.5モルのスクロース溶液のクッションをロードし、摂氏4度で100分間118, 000 Gで遠心分離します。遠心分離後、小胞はスクロースクッションの上部に円盤として現れます。上澄み液の約90%を捨てる。
濃縮小胞を回収するには、ピペッティングにより、2.5モルのスクロースを含む残りのバッファーに再懸濁します。懸濁液を氷冷式のDounceホモジナイザーに移し、ポリテトラフルオロエチレンポッターを使用して少なくとも10ストロークで懸濁液を均質化します。次に、各層に 2.2 ミリリットルのスクロース溶液を含む 11 ミリリットルのステップグラジエントを調製します。
この式を使用してスクロース濃度を計算します。最高濃度のスクロースを遠心分離チューブに加え、層が完全に凍結するまで摂氏マイナス20度に置きます。屈折計を使用してサンプルのスクロース濃度を測定します。
屈折計が利用できない場合は、スクロース濃度が2モルであると仮定します。スクロース濃度を0.6モルに調整するには、適切なMOPS、E-D-T-A、P-M-S-F、およびpH 7.4のプロテアーゼ阻害剤カクテルを添加します。グラジエントの乱れを避けるために、サンプルをスクロースグラジエントに慎重にロードします。
小胞を200、000G、摂氏4度で12時間遠心分離します。可能であれば、勾配が乱れないように、加速と減速を遅く設定します。次に、1ミリリットルのピペットを使用して、上から下へのグラジエントを700マイクロリットルの画分で収穫します。
その結果、17のフラクションが得られ、十分な分離能が得られます。次に、200マイクロリットルの72%トリクロロ酢酸を個々の画分に添加し、溶液が均一になるまで混合することにより、トリクロロ酢酸沈殿を2回連続して実行します。フラクションを氷上で30分間インキュベートし、沈殿させたタンパク質を20、000G、摂氏4度で20分間遠心分離してペレット化します。
上澄みを捨てます。500マイクロリットルの28%トリクロロ酢酸溶液を加えます。よく混合し、遠心分離ステップを繰り返します。
最後に、SDS-PAGEおよびイムノブロッティングによりフラクションを分析します。軽度の超音波処理の重要性がここに提示されています。ミトコンドリア外膜マーカーTom40は、初期の低密度画分では濃縮され、後期の画分にはほとんど存在しませんでした。
ミトコンドリア内膜マーカーTim17は、高密度画分に濃縮された。対照的に、接触部位タンパク質Mic60は、中間スクロース濃度の違反を蓄積し、さまざまな膜小胞の生成とその後の分離に成功したことを示しています。対照的に、より過酷な超音波処理条件では、ミトコンドリア外膜マーカーTom40は、勾配のより低い画分で検出され得る。
さらに、Tim17の中間密度の違反がかなりありました。
