まず、RCAS(A)レトロウイルスストックを氷上で解凍します。マイクロピペットの目詰まりを防ぐために、溶液を10, 000 Gで摂氏4度で10秒間遠心分離し、溶液を氷上に保持しながら上清を新しいチューブに移します。35 x 10 mmの細胞培養皿に延伸した実験用パラフィルムを置き、パラフィルムに1マイクロリットルの滅菌PBSを加えます。
準備したガラス製マイクロピペットを自動Picoインジェクターに接続します。充填モードを押してPBSをマイクロピペットに充填し、注入モードを押して割り当てられた1マイクロリットルの液体をテストします。延伸した2枚目の実験用パラフィルムを新しい細胞培養皿に置き、1マイクロリットルの高速緑色染色ウイルスストックをフィルムに加えます。
マイクロピペットの先端をウイルスストックに下ろし、フィルモードを押してマイクロピペットに1マイクロリットルのウイルスストックを充填します。解剖顕微鏡下で、自動注射器に接続された充填されたマイクロピペットをニワトリ胚レンズの標的領域に下げます。次に、光源を調整して、レンズの小胞がはっきりと見えるようにします。
マイクロピペットが水晶体内腔内の正しい位置にあることを確認した後、5〜40ナノリットルのウイルスストックを注入します。注入後、45秒待ってからマイクロピペットを静かに取り外します。次に、レンズの空の内腔内の高速緑色色素を漏れなく調べて、マイクロインジェクションが成功したことを確認します。
検査後、卵殻の開口部をセロハンテープで密封し、卵を摂氏37度の加湿静置インキュベーターに入れます。この研究は、免疫蛍光法によるキメラコネクソン50および43ループの組織学的評価を示しています。アンチフラッグ標識を用いて、外因性のコネクソンを内因性のコネクソンと区別した。
また、この研究では、コネクソン50の細胞内ループドメインとアクアポリンゼロの相互作用も評価しています。
