代謝物抽出のためのサンゴの宿主組織と共生虫科細胞の分離

サンプルが完全に均質化され、塊が見えなくなるまで、機械的な鋸歯状ホモジナイザーでサンゴサンプルを1分間均質化します。ノーマライゼーションのために、ホモジナイズした組織から 1 ミリリットルのアリコートを採取して、シンビオディニア科の細胞数、サンゴ組織のタンパク質含有量分析、およびクロロフィル A の推定を行います。宿主材料と藻類細胞を分離する場合は、残りのサンゴホモジネートを2、500Gで4°Cで5分間遠心分離します。

ホスト材料を含む上清を新しい15ミリリットルのチューブに移します。藻類ペレットに2ミリリットルの冷たい超純水を加え、宿主材料と藻類ペレットの両方を2分間ボルテックスして再懸濁します。すべてのサンプルを再度遠心分離し、ホスト物質を含む上清を新しい15ミリリットルのチューブに移します。

藻類ペレットから上澄み液を廃棄した後、ペレットを元の15ミリリットルのチューブに保持します。ホロビオントホモジネートまたは分離された宿主のいずれかを、摂氏マイナス80度で少なくとも2時間ブリーズします。次に、摂氏マイナス85度で0.01ミリバールの真空でサンプルを一晩凍結乾燥します。

乾燥後、各サンプルをラボ用天びんで秤量し、可塑剤を含まない2ミリリットルの微量遠心チューブに入れます。顕微鏡による可視化により、3回の洗浄ステップの後、宿主組織サンプル中にSymbiodiniaceae細胞は検出されませんでした。同様に、共生生物の分画に最小限の宿主組織が見られました。

しかし、ホロビオントホモジネートは、細胞内のSymbiodiniaceaeが単純なエアブラシによって共生体から解放されていないことを示しました。