凍結乾燥したホロビオントから細胞内代謝物を抽出するには、凍結乾燥したホロビオントに内部標準を含む400マイクロリットルの100%コールドメタノールを加えます。次に、10ミリグラムの酸で洗浄したガラスビーズを加え、チューブを事前に冷やしたビーズミルに入れます。50ヘルツで3分間挿入します。
溶解後、600マイクロリットルの冷たいメタノールを加え、1分間ボルテックスします。チューブを摂氏4度のロティサリーシェーカーに30分間置きます。分離された凍結乾燥共生動物細胞から代謝物を抽出するには、乾燥した共生動物細胞に内部標準を含む200マイクロリットルの冷たいメタノールを加えます。
次に、酸で洗浄したガラスビーズを加え、チューブを50ヘルツで事前に冷やしたビーズミルインサートに入れます。3分後、800マイクロリットルのメタノールを加え、30秒間ボルテックスします。分離した凍結乾燥した宿主組織から代謝物を抽出するには、内部標準を含む1ミリリットルの冷メタノールを乾燥した宿主材料に加え、20秒間ボルテックスします。
次に、チューブをフローティングチューブホルダーに入れて、摂氏4度で30分間超音波処理します。次に代謝物抽出物精製では、すべてのサンプルを3000Gで摂氏4度で30分間遠心分離します。ペレットを乱すことなく、上清を新しい2ミリリットルのマイクロ遠心チューブに慎重に移します。
ペレットを1ミリリットルの50%冷メタノールに再懸濁し、1分間激しくボルテックスします。再度遠心分離し、極性抽出物上清を回収し、同じサンプルから半極性抽出物とプールします。プールした抽出物を16、100Gで15分間遠心分離し、沈殿物を除去します。
分析のために、各抽出物50マイクロリットルをガラスインサートに分注し、真空濃縮器を使用して摂氏30度で30分間濃縮します。GCMS 分析により、一連のアミノ酸、有機酸、炭水化物、脂肪酸、無菌など、すべての処理で 107 のアノテーション付き代謝物が明らかになりました。K は、サンプルの 3 つの異なるクラスターが識別されたクラスタリングを意味します。
ホロビオント試料は、分離された宿主分画と共生生物分画の中間であった。Kはクラスター分布を意味するが、代謝産物の相対存在量の平行座標とヒートマップの可視化は、ホロビオントプロファイルが宿主分率プロファイルと共生生物プロファイルの両方と有意に異なることを示した。宿主と共生生物のプロファイルは、100個の代謝産物で互いに有意に異なっており、宿主と共生生物の画分で有意に異なっていました。
