まず、チップとチップキャリアを滅菌組織培養皿にあるチップクレードルに入れ、チップ活性化試薬を調製する間、組織培養フードに入れておきます。CR1粉末を含むバイアルに1ミリリットルのCR2溶液を加えます。溶液をバイアルからアルミホイルで包んだ15ミリリットルのチューブに移します。
このプロセスを繰り返して、4回のすすぎと4ミリリットルのCR2がCR1バイアルから洗い流されます。最後のすすぎでは、バイアルに蓋をして裏返し、残留粉末を取り除きます。次に、CR1を含む15ミリリットルのチューブに6ミリリットルのCR1を追加します。
最終的な10ミリリットルの溶液を気泡を発生させずにピペットで混合します。200マイクロリットルのピペットチップを使用して、20マイクロリットルのCR1溶液をチップの下部チャネル入口に添加し、溶液が下部チャネル出口から出始めるまで添加します。溶液が上部チャネル出口から出始めるまで、上部チャネルの入口から50マイクロリットルのCR1溶液を追加します。
次に、チップを紫外線下に15分間置きます。曝露後、上部と下部のチャネルからCR1溶液を取り除きます。両方のチャネルを100マイクロリットルのCR2溶液で洗浄します。
その後、100マイクロリットルのDPBSで2回洗浄します。チップの上部と下部のチャネル用の細胞外マトリックス溶液を調製します。50マイクロリットルの細胞外マトリックス溶液を、液滴が出口に現れるまで、下部チャネルインレットに追加します。
次に、水滴が入口に現れるまで、上部チャネルの入口に50マイクロリットルを追加します。DPBSをチップクレードルリザーバーに追加します。プレートに蓋を置き、チップを摂氏37度、5%二酸化炭素インキュベーターで一晩インキュベートします。
翌日、チップの上皮またはトップチャネルを100マイクロリットルの予熱したチップ膨張培地で洗い流します。次に、内皮チャネルまたは底部チャネルを100マイクロリットルの予熱したHIMEC培地で洗い流します。カウント後、10マイクロリットルのHIMECを内皮チャネルに追加します。
必要に応じて、オルガノイド増殖培地またはチップ増殖培地を上皮チャネルに添加し、HIMECの播種密度を確認します。次に、細胞培養皿に入れたチップクレードルにチップを反転させ、チップクレードルのリザーバーにDPBSを添加し、チップを37°Cで2〜3時間置いて、HIMECがチップ膜に付着できるようにします。インキュベーション後、チップクレードルを直立位置に戻します。
内皮チャネルを100マイクロリットルの温かいHIMEC培地で静かに洗浄し、上皮チャネルをオルガノイド増殖培地またはチップ増殖培地で穏やかに洗浄し、培地をチャネルに残します。エンテロイドを回収するには、培地を穏やかに吸引し、細胞培養マトリックスハイドロゲルを含むウェルを500マイクロリットルの温かいDPBSで洗浄します。各ウェルに250マイクロリットルのコールドセル回収溶液を添加し、新しいピペットチップで各ウェルの底を引っ掻いて、細胞培養マトリックスハイドロゲルを破壊します。
破壊した細胞懸濁液を氷上の冷たい15ミリリットルチューブに入れ、45分間インキュベートします。インキュベーション後、懸濁液を遠心分離し、上清を除去します。次に、2ミリリットルの温かい腸内解離培地をペレットに加え、チューブを摂氏37度のウォーターバスに入れます。
次に、60〜120秒間、10ミリリットルの冷たティッシュ洗浄剤をチューブに加えます。次に、遠心分離して上清を除去してから、ペレットを200マイクロリットルのチップ膨張培地に再懸濁します。P200ピペットを使用して、エンテロイドを解離し、懸濁液を1.5ミリリットルのマイクロ遠心チューブに加えます。
細胞をカウントし、チップ膨張媒体の容量を調整して、10 の 6 倍の濃度から 6 セル/ミリリットルの濃度を達成します。次に、30マイクロリットルの再懸濁細胞懸濁液をチップの上部チャネルに加えます。チップをチップクレードルに戻した後、DPBSをリザーバーに添加し、チップを摂氏37度、二酸化炭素5%で一晩インキュベートします。
翌日、上皮チャネルを100マイクロリットルのチップ増殖培地で2回、内皮チャネルを100マイクロリットルのHIMEC培地で洗い流します。次に、2ミリリットルのチップ膨張媒体を上部チャネル入口リザーバーに追加し、300マイクロリットルを上部チャネル出口リザーバーに追加します。2ミリリットルのHIMEC培地を下部チャネル入口リザーバーに追加し、300マイクロリットルを下部チャネル出口リザーバーに追加します。
ポッドをプライミングし、チップをポッドに追加します。次に、ポッドを培養モジュールに追加します。毎時30マイクロリットルの流量を設定し、サイクルを開始します。
新生児の腸管をチップ上に乗せて増殖させた腸管上皮細胞は、コンフルエント細胞単層を形成し、その後、成熟した立体的な絨毛状構造に発達した。重度の壊死性腸炎の新生児由来の細菌叢異常微生物叢を新生児腸にチップモデルに追加すると、対照群と比較してTNF-αの発現が増加したことが示されました。
