まず、ショウジョウバエ幼虫の死骸と標識した抗体を0.2%PBSTでスライドガラス上に置きます。実体顕微鏡で調整し、幼虫の死骸の内面が上を向くようにします。ワイプを使用して余分なPBST溶液を吸収します。
次に、退色防止封入剤を一滴加えます。次に、解剖した幼虫を覆うスライドにカバースリップを置き、気泡の発生を防ぎます。カバースリップの端にマニキュアを塗って、カバースリップを所定の位置に固定します。
スライドは暗い場所に保管して、蛍光の減衰を最小限に抑えます。画像取得には、レーザー走査型共焦点顕微鏡と63倍油浸対物レンズを使用します。次に、実験の要件に最も適するように波長とレーザー出力を調整します。
神経筋接合部を同定し、セグメントA3の筋肉4の画像を撮影するには、488ナノメートルのレーザーを選択してアルファチューブリンまたはフッチを活性化し、546ナノメートルのレーザーを選択してHRPイメージングトラックを活性化します。パラメーターを変更して、フレーム サイズを 1, 024 x 1, 024 ピクセル、デジタル ズームを 1.0、イメージング間隔を 0.8 マイクロメートルにします。筋肉の微小管を視覚化するには、気管枝が少ないため、セグメント A 3 から A 5 の筋肉 2 の画像を撮影します。
αチューブリンの活性化には488ナノメートルレーザーを、T3605イメージングトラックの活性化には633ナノメートルレーザーをお選びください。イメージングパラメータを、フレームサイズを1, 024 x 1, 024ピクセル、デジタルズームを2.0、イメージング間隔を0.4マイクロメートルに調整します。神経筋接合部のシナプス前部およびシナプス後部の両方の微小管組織を抗αチューブリンで標識した。
フッチ染色は、シナプス前ニューロンの安定な微小管の存在量を反映していた。シナプス前ニューロンにおいて、タンパク質カタニン60を切断する微小管が過剰発現すると、抗フッチのシグナル強度の低下が観察された。軸索幹の染色強度は、枝の染色強度よりも強かった。
カタニン60の変異は、微小管ループの増加をもたらした。カタニン60の過剰発現により、末端ボタン内に短い微小管断片が生じた。αチューブリン染色は、核の周囲に微小管の明確なネットワークがあることを示しました。
筋細胞は、カタニン60変異体において、核周囲微小管強度が有意に増加し、より強い束を示した。過剰発現により、微小管線維が断片化しました。
