まず、500ミリリットルの三角フラスコに入った200ミリリットルの滅菌ルリアブロスに単一の細菌コロニーを接種します。37度に設定されたシェーカーインキュベーターでバクテリアを一晩培養します。14時間培養後、600ナノメートルでの細菌の光学濃度を確認します。
バクテリアを50ミリリットルの円錐形チューブに分注し、さらに使用するために摂氏4度で保存します。血清ピペットを使用して、50ミリリットルの細菌培養物を新しい250ミリリットルの三角フラスコに移します ライブコントロールまたはモック処理コントロール用にチューブを標識します。血清ピペットを使用して、50ミリリットルのバクテリアを50ミリリットルのコニカルチューブに移し、洗浄前に模擬処理したコントロールを行います。
ケミカルフードで、781マイクロリットルのパラホルムアルデヒドを細菌培養物に追加して、最終濃度0.5%を達成します使用済みのチップは固形廃棄物のケミカルハザードコンテナに廃棄します。次に、フラスコをホイルのシートで覆い、摂氏37度のシェーカーインキュベーターに1時間入れます。インキュベーションが完了したら、バクテリアを洗浄して残留パラホルムアルデヒドを取り除きます。
残留パラホルムアルデヒドを除去するには、血清ピペットを使用して、処理した細菌を三角フラスコから50ミリリットルの円錐管に移します。次に、処理した細菌を約3000Gで20分間遠心分離します。上澄み液を薬品フード内の廃薬品危険容器に廃棄します。
次に、処理した細菌ペレットとコントロール細菌ペレットに25ミリリットルのルリアブロスを加え、ボルテックスして細菌ペレットを再懸濁します。遠心分離とペレット再懸濁を4回繰り返します。さまざまなアッセイの準備として、ペレットを適切な量で再懸濁します。
寿命アッセイ用。200マイクロリットルのバクテリアを10ミリリットルのルリアブロスに再懸濁し、60ミリメートルのプレートに播種します。バクテリアは摂氏4度で保管してください。
細菌増殖の品質チェックを行うには、滅菌ピペットチップを使用して、調製した細菌でLuriaブロスプレートをストリークします。汚染を確認するために、洗浄に使用したルリアブロスをステーキし、別の皿に再懸濁します。次に、プレートを摂氏37度のインキュベーターに一晩置きます。
翌日、細菌の増殖を確認します。パラフォームアルデヒドの調製が成功し、LBプレート上でコロニーが増殖しない場合は、バクテリアを保存します。呼吸計で細菌の代謝活動をチェックするには、まず96ウェルプレート上のすべてのウェルに200マイクロリットルのキャリブラントを追加してカートリッジを水和させます。
カートリッジを96ウェルプレートに入れ、摂氏37度で一晩インキュベートします。混合、重量、測定、およびループするようにマシンを設定します。翌日、水和カートリッジを機械に入れます。
新しい96ウェルプレートに、160マイクロリットルのM9をテストウェルに加え、続いて40マイクロリットルの調製したバクテリアを加えます。200マイクロリットルのM9を四隅ウェルに追加して、ブランクとして機能させます。ネガティブコントロールとして160マイクロリットルのM9と40マイクロリットルのルリアブロスを分注します。.
最後に、200マイクロリットルのM9を残りの未使用のウェルにピペットで移します。次に、プログラムを実行する前に、排出したキャリブレーションプレートをアッセイプレートと交換します。結果は酸素消費率として表示されます。
菌株が異なれば、パラホルムアルデヒドに対する不活化反応時間も異なります。例えば、HB101バクテリアを0.25%に1時間曝露すると、代謝的に不活性になります。エンテロコッカス・フェカリスは、一貫した効果を得るために1.0%の濃度を必要としました。
Caenorhabditis elegans線虫は、処理したOP 50株と模擬処理した対照に対して同様の選好を示した。しかし、高感度のペアワイズアッセイでは、模擬処理したコントロールがより強く好ましいことが明らかになりました。処理されたOP 50の線虫は、模擬処理されたコントロールの線虫よりも高いポンプ速度を持っています。
処理された細菌の消費は、野生型線虫の発育時間の遅れ、産卵能力の低下をもたらしました。線虫の寿命は、食物源に関係なく、互いに有意差はありませんでした。しかし、パラホルムアルデヒド処理された細菌は、5-フルオロ-2'デオキシウリジンの存在下で線虫の寿命を延ばし、パラホルムアルデヒド処理された細菌を長寿命の線虫株が消費しても、その寿命は変化しませんでした。
