まず、フィジーでマルチチャンネルZスタックイメージを開き、目的のバイオセンサー解析スクリプトファイルを開きます。スクリプト エディタ ウィンドウで [実行] をクリックして、スクリプトを実行します。次に、表示されるダイアログウィンドウに要求された情報を入力します。
比率計算用の分子と分母のチャンネル番号を選択します。ミトコンドリアを標的とするHyPer7の場合、分子は488ナノメートルで励起されたチャネルであり、分母は405ナノメートルで励起されたチャネルです。透過光画像が存在する場合はチャネル番号を選択し、存在しない場合はゼロを選択します。
次に、目的の背景減算方法を選択します。背景が均一な場合は、[画像領域の選択] をクリックして、画像の背景レベルを測定します。その後、検出器の読み出しのランダムな変動を低減するために、目的のノイズ減算方法を選択します。
[画像領域の選択] をクリックします。固定値オプションを選択すると、以前に測定されたノイズレベルが入力されますが、これは通常、イメージング条件が一定に保たれている場合に適しています。ミトコンドリアを正確かつ一貫して検出するには、OtsuやMaximum Entropyなどの閾値アルゴリズムを選択します。
実験では、すべての画像に同じアルゴリズムを使用しますが、ミトコンドリアが正確に認識されるようにします。次に、セルごとの関心領域の数を選択します。たとえば、母芽の違いを測定する場合は、2つを選択します。
測定値と比率の画像を保存する出力フォルダーを選択します。背景またはノイズを補正するには、[画像領域の選択] を選択します。プロンプトに従って、長方形の ROI ツールを使用して背景領域を描画し、[OK] をクリックします。
個々の細胞または細胞内領域を解析する際には、明視野画像に基づいて関心領域を描画します。ROI内の閾値ミトコンドリアのみが測定されるため、ROIは細胞の輪郭と正確に一致する必要はありません。各 ROI を作成したら、T キーを押して、選択した ROI を ROI マネージャーに追加します。
ROI マネージャーの [すべて表示] をオンにして、マークされたセルを文書化します。追加された各領域は、ROIマネージャーリストに番号付きの項目として表示されます。1 つのセルに複数の ROI を解析する場合は、解析された各セルに対して同じ順序で ROI をマークします。
必要なすべてのROIがROIマネージャーに追加されたら、[セルをマーク]ダイアログウィンドウで[OK]をクリックします。次に、測定表の形式を選択します。[Multi Measure] ダイアログ ウィンドウで、[measure-all-slices] オプションと [One-row-per-slice] オプションをオンにして、目的の形式のテーブルを作成します。
プロセスの複数ROI表を使用します。rscript を使用して、1 行/スライス オプションで作成されたテーブルを処理します。append-results オプションはチェックしないでください。
スクリプトを使用して、選択したフォルダーに出力ファイルを保存します。次に、フィジーで比率 Z スタック画像を開き、色付けされた比率画像を生成します。次に、colorize_ratio_imageを開きます。
ijm スクリプトファイルを選択し、スクリプトエディタウィンドウで「実行」(Run) をクリックします。要求された情報の入力を求めるダイアログウィンドウが表示されます。変調されていないオプションでは、すべてのミトコンドリアピクセルが同じ明るさで表示されます。
一部の画像は、暗いピクセルと明るいピクセルが比率画像に寄与するため、ノイズが多く見える場合があります。強度変調オプションを使用して、ノイズを低減します。最小値と最大値の表示方法では、実験で観測された平均の最小値と最大値に近い値を選択します。
一貫性を保つために、すべての画像を同じ撮影条件で取得し、すべての画像を同じ最小値と最大値で表示します。次に、投影モードを選択してZスタックを投影し、色付け前のミトコンドリア集団全体を表示します。最大強度投影の場合は、最大(maximum)を選択します。
平均強度予測を作成するには、平均を選択します。最後に、色付けされた画像を保存するフォルダを選択します。「無変調」オプションを選択した場合は、表示されるダイアログウインドウで配色を選択します。
フィジーに組み込まれている火や虹のRGBルックアップテーブル、またはImageJのLUT形式の任意のルックアップテーブルを利用します。スクリプトを使用して、選択したフォルダーに出力ファイルを保存します。HyPer7とタグ付けされたミトコンドリアの酸化還元比は、過酸化水素濃度に対する用量依存的な反応を示し、過酸化水素を外部から添加すると1〜2ミリモルでプラトーに達しました。
ミトコンドリアの過酸化水素の違いは、酵母細胞内で観察されました。過酸化水素バイオセンサーの読み出しの統計的に有意な減少は、母細胞と比較して芽のミトコンドリアで検出されました。
