Suspension-Trapping Sample Preparation of Human Tear Protein

まず、ヒト涙液タンパク質サンプルを50マイクログラムのタンパク質に正規化します。次に、200ミリモルのジチオスレイトール(DTT)を最終濃度の20ミリモルのDTTに加え、摂氏95度で10分間インキュベートします。タンパク質溶液を室温まで冷却した後、400ミリモルのヨードアセトアミドを最終濃度40ミリモルに添加し、室温で暗所で10分間インキュベートします。

次に、12%のリン酸水溶液を1対10の割合で添加し、最終濃度を1.2%にします。混合物を短時間ボルテックスして溶液を混合します。タンパク質結合バッファーを1対6の比率で添加してから、再度ボルテックスします。

懸濁液トラップマイクロスピンカラムのキャップを外し、スピンカラムを2ミリリットルのマイクロ遠心チューブに組み立ててフロースルーを回収します。最大 200 マイクロリットルの酸性タンパク質溶解液混合物をカラムに添加します。カラムを 4000 G で 20 秒間遠心分離します。

次に、150マイクロリットルのタンパク質結合バッファーを加え、前と同様に遠心分離機で懸濁タンパク質を洗浄します。懸濁液捕捉マイクロカラムを新しい1.5 mmリットルの微量遠心チューブに組み立てます。20マイクロリットルのTEAB分解バッファーをスピンカラム内のフィルターに慎重に添加し、気泡やエアギャップを避けます。

懸濁液トラップマイクロスピンカラムをしっかりとキャップし、蒸発を防ぎます。サーマルミキサーで摂氏47度で1時間、振とうせずにインキュベートします。40マイクロリットルの50ミリモルTEABでペプチドを溶出します。

その後、4000Gで20秒間遠心分離します。次に、40マイクロリットルの0.2%ギ酸を加え、以前と同様に遠心分離します。最後に、35マイクロリットルの0.2%ギ酸と50%をアセトニトリルに加えてから、再度遠心分離します。

3つの溶離液を抜き、真空遠心分離機で乾燥させます。乾燥したら、サンプルを摂氏80度で保存し、後で分析します。データ依存的な取り込み検索により、懸濁トラップ群で合計1183プラスマイナス118タンパク質、溶液内グループで1%FDRで874プラスマイナス70タンパク質が得られました。

遺伝子オントロジー解析により、結合触媒活性と分子機能制御を主な機能とする両方のアプローチで類似したプロテオームが明らかになりました。