まず、メンブレンマトリックスでコーティングされた6ウェルプレート上の人工多能性幹細胞またはiPS細胞を2ミリリットルのDPBSで洗浄します。ピペットを使用してDPBSを吸引します。次に、市販の細胞剥離液を1ミリリットル添加してiPS細胞を剥離します。
次に、細胞を37度のインキュベーターに5分間入れます。次に、1ミリリットルのmTeSRをiPS細胞にピペットで移し、細胞がプラスチック表面から分離していることを確認します。これらの細胞を室温で400gで3分間遠心分離します。
細胞ペレットを再懸濁し、血球計算盤を使用して細胞数をカウントします。次に、メンブレンマトリックスでコーティングされた6ウェルプレート上に、さまざまな細胞密度を播種します。これらを10マイクロモルのRhoキナーゼ阻害剤を添加したmTeSRで培養します。
プレートを摂氏37度に設定した二酸化炭素インキュベーターで一晩培養します。翌日、mTeSRを吸引し、2ミリリットルのDPBSで細胞を洗浄します。次に、2ミリリットルのステージ1培地を細胞に加えます。
次に、細胞を摂氏37度のインキュベーターに4日間入れます。4日目に、ステージ1の培地を除去し、2ミリリットルのDPBSで細胞を洗浄します。次に、前と同じように細胞をインキュベートする前に、2ミリリットルのステージ2培地を細胞に加えます。
0日目から4日目にかけて、iPS細胞は急速に拡大し、菱形または三角形の形をしていました。合流点は90〜100%に達し、7日目まで均等に蓄積されました。浮遊培養では、凝集体は7日目に解離した後、自発的にネフロン構造を形成します。