Generating Kidney Organoids from Induced Pluripotent Stem Cell Suspension Culture

まず、培養7日目にiPS細胞懸濁液からステージII培地を取り出します。次に、2ミリリットルのDPBSで細胞を洗浄します。各ウェルに1ミリリットルの細胞剥離溶液をピペットで移します。

次に、プレートを37度のインキュベーターに5分間入れます。インキュベーション後、1ミリリットルのステージII培地を細胞に加え、細胞が表面から剥離するまで完全に混合します。細胞懸濁液を15ミリリットルのチューブに集め、室温で400gで3分間遠心分離します。

遠心分離後、上清を廃棄し、細胞ペレットを2ミリリットルのステージIII培地に再懸濁します。溶液を穏やかに混ぜます。次に、懸濁液を6ウェルの低接着プレートに1対3の比率で播種します。

プレートを、5%の二酸化炭素を含む摂氏37度に設定されたインキュベーター内の軌道シェーカーに置きます。懸濁培養液中の培地を除去するには、まず無菌ハサミを使用して1ミリリットルのピペットの先端を切り取ります。次に、6ウェルプレートを静かに攪拌し、オルガノイドを集中させます。

次に、準備したピペットでオルガノイドを吸引し、15ミリリットルのチューブに入れて5分間放置します。上清を吸引し、オルガノイドがチューブの基部にとどまるようにします。次に、ステージIII培地をプレートにピペットで移します。

混合物をピペットで移し、オルガノイドを再懸濁します。オルガノイドを6ウェルの低接着プレートに再播種します。インキュベーター内で低接着プレートを毎分60回転で振とうし続けます。

12日目に、培地をステージIV培地と交換します。腎臓オルガノイドは管状の構造を示し、凝集の18日後に明視野画像で容易に観察されます。CD31内皮細胞を誘導した。

デキストランは腎臓オルガノイドの近位尿細管に取り込まれた。