まず、麻酔をかけたマウスの手足を粘着テープで固定します。腹部の皮膚を上に保持し、胸部の円周に沿って慎重に切り取り、完全に露出させます。眼科用ハサミで右心房に小さな切り込みを入れ、すぐに左心室の頂点に灌流22ゲージの針を挿入します。
次に、30〜50ミリリットルの心灌流液をシリンジに押し込みます。.右心房からの流出液が完全に透明になったら、等量の4%PFA溶液を注入します。組織や臓器を解剖し、摂氏4度で4%PFAで一晩固定します。
組織の脱灰を誘導する。固定された心臓組織を10ミリリットルのEDTA溶液に入れ、摂氏37度の振とう台に置きます。約2日間インキュベートし、毎日液体を交換します。
固定された頭蓋骨を20ミリリットルの25%Quadrol溶液に入れて、組織の脱色を行います。摂氏37度の振動台で1日インキュベートし、液体を1回交換します。次に、組織を30%三級ブタノールまたは結核溶液に順次入れます。
次に 50%TB 溶液、次に 70%TB 溶液でグラジエント脱脂を行います。続いて、サンプルとTB PEG溶液を摂氏37度の振とう台で6時間脱水します。最後に、完全に脱水した組織をBB PEG溶液に入れ、摂氏37度の振とう台に置きます。
2〜4時間のインキュベーション後、組織は透明になります。PEGASOS Tissue Clearing Methodにより、透明な組織が得られました。ホールマウントEDU染色で透明化した組織は、標識が効率的で保存状態が良好であることを示しました。
対照群では、いくつかのEDU陽性細胞が縫合糸全体にびまん性に分布していた。縫合糸の拡張の1日後、縫合糸の中央と端に増殖細胞が観察されました。縫合糸が広がるにつれて、増殖する細胞の数は時間の経過とともに減少しました。
緑色で標識された細胞は、骨髄の小さな丸い細胞であり、EDU陽性の縫合糸細胞とは異なりました。
