In Planta Gene Expression and Measurement of Chlorophyll Fluorescence of Non-Photochemical Quenching Values in Bamboo Leaves

まず、野生型とアグロバクテリウムに感染した笹の葉からゲノムDNAを抽出します。野生型およびアグロバクテリウムに感染した笹の葉から、標的遺伝子の標的部位を含むゲノムDNAを以下のPCR条件で増幅します。PCR後、1マイクロリットルの1マイクロリットルのAge-1、1マイクログラムのPCR産物、および5マイクロリットルの10Xバッファーを含む反応混合物を調製して、エンドヌクレアーゼ酵素消化を行います。

次に、最終容量の50マイクロリットルまで水を追加します。分解混合物を摂氏37度で1時間インキュベートします。ゲル電気泳動を用いて、消化されたDNA断片の割合を分析します。

野生型サンプルとアグロバクテリウム感染サンプルの消化断片を比較して、遺伝子編集効率を評価します。竹の苗木を高光強度条件にさらして、吸収光量を増やし、葉の光保護システムを活性化します。次に、IMAGING-PAM蛍光光度計をオンにし、活性光強度を設定して、笹の葉のin vivo光化学系IIクロロフィル蛍光を測定します。

RUBY遺伝子が産生する赤色のベータレーン色は、笹の葉におけるアグロバクテリウムを介した遺伝子発現の成功を示しました。4つのアグロバクテリウム株のうち、GV3101株は感染した笹の葉に最も有意なベータレーンの蓄積を引き起こしました。CRISPR-Cas9コンストラクトと高光処理による感染後、葉身の特定の領域は非光化学的消光値の低下を示しました。

さらに、酵素消化およびシーケンシング解析により、編集された領域におけるPeVDE遺伝子の変異が成功したことが確認されました。sgRNA1とsgRNA2の両方による編集後のPeVDEフラグメントのサンガーシーケンシングの結果、PeVDE遺伝子の長いフラグメントの欠失が示されました。アグロバクテリウム感染から30日後、PeVDEとPeCCR5の両方のsgRNAをトランスフェクションした葉の領域は、より低い非光化学的消光値を示しました。