Cerebral Thrombus Clot Dissolution and Cell Staining for Cell Component Analyses

まず、採取した脳血栓サンプルをピンセットを使用して清潔な皿に置きます。次に、ピペットを使用して、5ミリリットルの生理食塩水を加え、皿を静かに振る。ピペットを使用して生理食塩水を取り除きます。

はさみを使って、血栓を細かく刻みます。もう一度、5ミリリットルの生理食塩水を血栓に加え、皿を静かに振ってから、ピペットで生理食塩水を吸引します。次に、ピンセットを使用して、血栓の破片を新しい清潔なUプレートに移します。

生理食塩水を使用してSFEの濃度を2、000単位/ミリリットルに調整することにより、SFE作業溶液を調製します。前処理した血栓に300マイクロリットルのSFEワーキング溶液を加えます。分解の最初のラウンドを開始するには、SFEと血栓の混合物を摂氏37度で30分間インキュベートします。

その後、静かに振とうして、SFE処理したサンプルを混合します。そして、清潔なピペットを使用して、液体部分を滅菌チューブに移します。残りの血栓は、別の分解のために取っておきます。

回収した液体を200Gで4°Cで5分間遠心分離します。次に、ピペットを使用して、上清または回収したSFE溶液を別のクリーンチューブに移します。得られた細胞ペレットを50マイクロリットルの生理食塩水に穏やかに混合して再懸濁します。

この後、前述したように、回収したSFE溶液を使用して、残りの血栓の分解を後続で行います。分解の各ラウンドから細胞混合物を収集して、血球サンプルを調製します。得られた細胞試料を5マイクロリットル、ポリ-L-リジンでコーティングしたスライドガラスに加える。

そして、カバースリップを使用して、細胞を塗抹します。液体を室温で蒸発させます。細胞染色を行うには、細胞塗抹標本に100マイクロリットルの右色素を静かに添加します。

細胞を室温で30分間染色してから、きれいな水で染料をやさしく洗い流します。最後に、染色した細胞を光学顕微鏡で調べます。無色の作業溶液を含むコンパクトな赤血栓が、分解の初期段階で観察されました。

30分のインキュベーション後に血栓の溶解が観察され、最大5時間の長時間のインキュベーションでほとんどの血栓が溶解したが、10時間のインキュベーション後でもネガティブコントロール群には有意な変化はなかった。適切な染色後、成熟した赤血球、血小板、およびさまざまな顆粒球が光学顕微鏡ではっきりと識別できました。細胞成分は、自己血液学の助けを借りて定量的に分析することに成功しました。