まず、異なる薬物を含む2ミリリットルのMCF-7細胞を6ウェルプレートのウェルに加えます。細胞培養液を摂氏37度、二酸化炭素5%で24時間インキュベートします。560 x gで摂氏4度で3分間遠心分離して細胞を回収します。
次に、細胞を予冷PBSで2回洗浄し、洗浄の合間に560 x gで3分間遠心分離します。洗浄した細胞に50マイクロリットルの溶解緩衝液を加え、サンプルを氷浴に15分間入れます。次に、サンプルを摂氏4度で10分間8, 550 x gで遠心分離し、上清タンパク質サンプルを回収します。
タンパク質サンプルとローディングバッファーを4対1の比率で組み合わせます。次に、混合物を金属浴中で100°Cで10分間変性させます。次に、混合物を室温で冷却します。
10%SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動を使用してタンパク質サンプルを分離します。タンパク質を0.22マイクロメートルのPVDFメンブレンに転写します。メンブレンを5%BSAでブロッキングした後、対応する一次抗体とともに摂氏4度で一晩インキュベートします。
翌日、メンブレンをヤギ抗ウサギIgG二次抗体と摂氏37度で2時間インキュベートします。次に、ECL化学発光溶液を使用してメンブレンを現像し、非接触定量ウェスタンブロットイメージングシステムを使用して画像を取得します。ウェスタンブロットでは、サリドロシド処理により、アポトーシス促進因子であるCC-9、CC-7、CC-3、Bim、およびBaxのタンパク質発現が促進され、抗アポトーシスBCL-2のタンパク質発現が阻害されることが示されました。
サリドロシドは、p-PI3KとPI3K、およびp-AKTとAKTの比率を顕著に制限しました。一方、mTOR、HIF-1α、およびFox01のタンパク質発現も顕著に抑制されました。
