MCF-7細胞を560-Gで3分間、摂氏4度で遠心分離して回収します。500マイクロリットルの緩衝RL-1を6つの細胞に10の5倍に加え、細胞塊が見えなくなるまで完全に混合します。次に、細胞ホモジネートをコレクションチューブに埋め込まれたDNAクリーニングカラムに移します。
サンプルを85-50-Gで摂氏4度で2分間遠心分離します。遠心分離後、DNA洗浄カラムを取り外し、上清をコレクションチューブに保持します。800マイクロリットルの緩衝液RL-2と500マイクロリットルの上清を加え、穏やかに混合する。
次に、700マイクロリットルの混合物を、コレクションチューブに埋め込まれたRNAのみのカラムに移します。チューブを8、550-Gで1分間、摂氏4度で遠心分離します。次に、収集チューブ内のフロースルーを廃棄します。
RNA のみのカラムを、まず 500 mL のバッファー RW-1 で洗浄し、次に 700 ml のバッファー RW-2 で、各洗浄時に 8、550-G、摂氏 4 度で 1 分間遠心分離します。再度遠心分離して残留RW-2を除去した後、RNAのみのカラムを新しいコレクションチューブに移します。65°Cで予熱した100マイクロリットルのRNAフリー脱イオン水をRNAのみのカラムのメンブレンの中央に加え、2分間待ちます。
次に、8, 550-G、摂氏4度で1分間遠心分離し、RNA溶液を回収します。PCR用の反応混合物をセットアップし、システムのPCR反応条件を設定します。QRT PCR手順を実行します。
QRT PCRは、円筒性処理がアポトーシス促進因子であるCC-9、CC-7、CC-3、vim、およびvaxの遺伝子発現を促進し、抗アポトーシスBCL-2の遺伝子発現を阻害することを示しました。さらに、シリンドリサイド投与により、PI-3K、AKT、M-tor、HIF1-AlphaおよびFox-01の遺伝子発現レベルが低下した。
