まず、ニトロセルロースメンブレンを付着させた分割マウス網膜を4%パラホルムアルデヒドに氷上で30分間浸漬します。次に、パラホルムアルデヒドを5〜10ミリリットルの室温PBSと交換して、裂けた網膜を洗浄します。ニトロセルロースから裂けた網膜を取り除く前に、疎水性バリアペンを使用して、顕微鏡スライド上に円形のウェルを準備します。
井戸を5〜10分間風乾させます。その後、準備したウェルに裂けた網膜を置き、それらを浸すのに十分なPBSを加えます。解剖顕微鏡下で、細い絵筆で組織の端をそっと持ち上げ、網膜の周りを円を描いて膜から分離します。
鉗子と絵筆を使用して、網膜の浮遊部分の下から膜を取り除きます。次に、残りのPBSを慎重に吸引し、網膜組織が顕微鏡上の神経節細胞側を下にしてスライドするようにします。裂けた網膜の上部を横切るシナプトフィジンの免疫蛍光標識は、光受容体のシナプス末端が保持されていることを示しました。
しかし、視細胞核は存在せず、網膜が視細胞の軸索を介して分裂していることが確認された。シナプスの完全性は、ON-BC樹状突起のRGS11と視細胞シナプスリボンのCtBP2を標識することによって評価されました。分裂は、外側の網状層の光受容体末端の形態を損傷しませんでした。
裂けた網膜における赤血球の生存率は、近赤外核色素を用いて評価した。組織全体の細胞生存率の地域変動が観察され、一部の領域では細胞死が高く、ほとんどの赤血球は分裂後も生存可能であった。PKCαに対する赤血球およびカルビンジン-Dに対する水平細胞の免疫蛍光標識は、1時間のインキュベーション後に裂けた網膜に急速な抗体拡散を示しました。
