まず、12.5×7.5センチのろ紙を4枚用意します。2枚のシートを一緒に積み重ね、スタックを転写バッファーに入れて染み込ませます。PVDFメンブレンを95%エタノールに入れ、メンブレンをロッカー上で1分間攪拌します。
エタノールを思い出してください。メンブレンを転写バッファーに浸します。そして2分間攪拌します。
次に、浸漬濾紙を大きな蓋などの平らな可動面に置き、ローラーを使用して平らにします。ゲルリリーサーまたはピンセットを使用して、PVDFメンブレンをスタックに慎重に配置します。その後、このメンブレンの上に乾いた濾紙を1枚置き、ローラーを紙の上を滑らせて、メンブレンの表面にある余分なバッファーを吸収します。
メンブレンをこすらずに上部のろ紙を持ち上げて剥がします。単離した繊維サンプルを冷凍庫から取り出し、室温で解凍してから遠心分離し、サンプルを完全に再懸濁します。各サンプルの1マイクロリットルの液滴を、指定された膜領域の中央に配置します。
ピペットチップでメンブレンに触れないようにしてください。サンプルの液滴がメンブレンに完全に吸収されるまで15分間待ちます。次に、ゲルリリーサーまたはピンセットを使用して、湿らせた濾紙スタックからメンブレンを慎重に持ち上げます。
乾いた濾紙の上に置き、5分以上放置して脱水します。サンプルスポットが完全に白くなったら、メンブレンを再活性化します。次に、標的タンパク質の免疫標識に進みます。
シグナルパネルの強度を使用して、ドットブロット画像からMHCアイソフォームとアクチンシグナルの強度を分類する方法を学びます。強い、中程度、および少量の標的タンパク質の検出は、それぞれ飽和、中程度、および微弱なシグナルによって示されます。繊維の種類を特定するには、まずミオシン重鎖IIAとミオシン重鎖1の結果を比較します。
ミオシン重鎖アイソフォームを1つだけ表示し、飽和シグナル強度または中程度のシグナル強度を持つファイバーを文書化します。アクチンで検出され、ミオシン重鎖1またはIIAが検出されなかったファイバーを潜在的な2X型として記録します。中程度の不飽和アクチンシグナルを伴う微弱なミオシン重鎖アイソフォームシグナルが存在する場合は、未同定として記録します。
ターゲットタンパク質が微弱または検出されないサンプルは廃棄してください。MHCIIAとMHC1の両方の飽和または中程度のシグナルを示すファイバーは、ファイバータイプ固有の調製には使用しないでください。MYO1D 同定後、それぞれのMHCアイソフォームについて、飽和シグナルまたは中程度のシグナルを有するファイバーを組み合わせて、タイプ1およびタイプ2のサンプルを調製します。
各繊維タイプ固有のサンプルを10マイクロリットル使用し、メーカーのガイドラインに従って、SDSページに従ってプレキャストゲル上で分離します。ゲルイメージャーを使用して、メーカーのプロトコルに従ってターゲットMHCアイソフォームを検出します。すべてのファイバータイプ固有のサンプルにおける各MHCアイソフォームのシグナル強度を比較します。
ファイバータイプIDは、中程度または飽和したシグナル強度で正しいMHCアイソフォームによって確認されます。ドットブロットの免疫標識により、タイプ2ファイバー、タイプ1ファイバー、および潜在的なタイプ2Xファイバーの同定が可能になりました。繊維タイプ特異的サンプルは、ウェスタンブロッティングおよびミオシン重鎖特異的抗体を用いてバリデーションしました。
